黃酒對(duì)便秘模型小鼠通便及腸道菌群的影響

王麗媛，秦 文，李 巖，卓 勤，孫 靜，王晶波，楊 倬，黃 建，沈 葹，霍軍生，丁鋼強(qiáng)*

（中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 營(yíng)養(yǎng)與健康所，北京 100050）

黃酒是我國(guó)最古老的酒種，在中國(guó)乃至世界酒文化歷史上都占有重要的一席。作為我國(guó)最有發(fā)展前途的酒種之一，黃酒的功效已被大眾熟知并廣泛應(yīng)用。古今中外已有諸多記載，如《漢書(shū)·食貨志》中記載：“酒，百藥之長(zhǎng)”；《本草綱目》記載：“諸酒醇不同，唯米酒入藥用”。米酒即指黃酒，具有通曲脈、厚腸胃、潤(rùn)皮膚、養(yǎng)脾氣、扶肝、除風(fēng)下氣等治療作用[1]。

隨著研究的深入，越來(lái)越多的結(jié)果顯示黃酒在抗氧化、抗衰老以及代謝、免疫調(diào)節(jié)等方面具有良好功效[2]，這與黃酒中所含有的礦物質(zhì)、維生素、活性肽、糖類(lèi)尤其是低聚糖密切相關(guān)[3]。功能性低聚糖是在黃酒釀造過(guò)程中曲麥微生物酶的作用下產(chǎn)生的[4]，具有低甜度和低熱量的特點(diǎn)，被人們稱(chēng)為“膳食纖維”。已有研究表明，功能性低聚糖具有促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收利用及改善便秘等功效[5]，在人體胃中能抵抗胃酸的分解和α-淀粉酶的水解，具有較好的穩(wěn)定性，能夠進(jìn)入腸道發(fā)揮益生元的作用[6]，而黃酒對(duì)便秘癥狀的改善作用研究較少。本實(shí)驗(yàn)意在研究黃酒對(duì)小鼠通便功能作用，以及對(duì)便秘小鼠腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康雄性BALB/c小鼠共100只（無(wú)特定病原體（specific pathogenfree，SPF）級(jí)，體質(zhì)量18～22g，[生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2014-0006]）：購(gòu)于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司；動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)疾病預(yù)防控制中心南緯路動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)SYXK（京）2009-0032，室溫20～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h光照，12 h黑暗。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過(guò)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所倫理審查。

受試樣品：市售黃酒，標(biāo)示酒精度為15.0%vol。

藥物及試劑：鹽酸洛哌丁胺膠囊（每粒含鹽酸洛哌丁胺2 mg，國(guó)藥準(zhǔn)字H10910085）：西安楊森制藥有限公司；阿拉伯樹(shù)膠：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；活性炭粉、墨汁的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取阿拉伯樹(shù)膠10 g，加水80 mL，煮沸至溶液透明，稱(chēng)取活性炭5 g加至上述溶液中煮沸3次，待溶液冷卻后加水定容至100 mL，于4℃保存?zhèn)溆茫们皳u勻。0.5%鹽酸洛哌丁胺混懸液的配制：取鹽酸洛哌丁胺50mg（25粒），加水至10 mL；1%鹽酸洛哌丁胺混懸液的配制：取鹽酸洛哌丁胺100 mg（50粒），加水至10 mL。均臨用前配制。

1.2 儀器與設(shè)備

RV10 V-C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)IKA公司；ME403E天平：瑞士梅特勒公司；AC2-4S1生物安全柜：新加坡ESCO公司；5427R高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)EPPENDRF公司；Illumina HiSe2500測(cè)序儀：美國(guó)Illumina公司；NANO DROP紫外分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 小腸墨汁推進(jìn)率實(shí)驗(yàn)

健康雄性BALB/c小鼠共50只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組各10只。人體推薦量的10倍為中劑量組，另設(shè)5倍低劑量組和30倍高劑量組。按照《中國(guó)居民膳食指南》2016新版建議男性每日飲酒的酒精量不超過(guò)25 g為參照，標(biāo)準(zhǔn)人體質(zhì)量60 kg計(jì)算，人體每日飲酒量為100 mL，低劑量組=8.3mL/（kg·BW）、中劑量組=16.6mL/（kg·BW）、高劑量組=50mL/（kg·BW）。將黃酒進(jìn)行濃縮，用15%vol酒基按比例進(jìn)行調(diào)配。高、中、低劑量組灌胃受試樣品，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予蒸餾水，灌胃體積0.2mL/（10g·BW）。連續(xù)灌胃15 d后，各組小鼠禁食不禁水24 h。除空白對(duì)照組外，其他各組以0.5%鹽酸洛派丁胺混懸液，按末次稱(chēng)質(zhì)量對(duì)應(yīng)的灌胃量給予灌胃，空白組灌胃蒸餾水。30 min后以0.4 mL每只給予各組小鼠墨汁灌胃，25 min后立即脫頸椎處死，解剖分離腸系膜，剪取上端自幽門(mén)、下端至回盲部的腸管，輕拉成直線，測(cè)量小腸總長(zhǎng)度及墨汁推進(jìn)最前端長(zhǎng)度，計(jì)算小腸墨汁推進(jìn)率。

1.3.2 排便時(shí)間及糞便質(zhì)量實(shí)驗(yàn)

另50只健康雄性BALB/c小鼠，實(shí)驗(yàn)方法同小腸推進(jìn)率實(shí)驗(yàn)。便秘藥物為1%鹽酸洛派丁胺混懸液。小鼠墨汁灌胃后，動(dòng)物均單籠飼養(yǎng)，正常飲水進(jìn)食。從灌墨汁開(kāi)始，記錄每只動(dòng)物首粒排黑便時(shí)間及5 h內(nèi)排黑便的質(zhì)量。

1.3.3 腸道菌群分析

無(wú)菌環(huán)境下收集排便實(shí)驗(yàn)組所有動(dòng)物的新鮮糞便，封裝后凍存于-80℃冰箱進(jìn)行DNA提取與分析。小鼠糞便DNA提取采用華大基因自行研發(fā)試劑盒，使用通用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對(duì)16SrDNA的V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

應(yīng)用Illumina HiSe2500平臺(tái)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序類(lèi)型為PE250。下機(jī)數(shù)據(jù)濾除低質(zhì)量的reads，獲得clean data。序列拼接使用軟件FLASH（Fast Length Adjustment of Shortreads，v1.2.11），將雙末端測(cè)序得到的reads拼接成Tags，利用軟件USEARCH（v7.0.1090）將優(yōu)化好的Tags在97%的相似度下聚類(lèi)為分類(lèi)操作單元（operational taxonomic units，OTU），用于物種注釋及物種復(fù)雜度分析以及組間物種α-多樣性分析。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用軟件SPSS16.0處理，各組以變異數(shù)ANOVA進(jìn)行比較分析，數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，P≥0.05無(wú)顯著差異，0.01≤P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

表1 小腸墨汁推進(jìn)率實(shí)驗(yàn)各組小鼠體質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果Table 1 Determination results of body mass of mice in the ink propelling rates experimental group

表2 排便實(shí)驗(yàn)各組小鼠體質(zhì)量的檢測(cè)結(jié)果Table 2 Determination results of body mass of mice in defecation experimental group

由表1、表2可知，在小腸推進(jìn)率和排便兩組實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量沒(méi)有顯著差異（P≥0.05）。15 d的灌胃過(guò)程中，高劑量組小鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，在第7天和第15天小鼠體質(zhì)量與模型對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，高劑量組與模型組小鼠體質(zhì)量增量差異極顯著（P＜0.01）。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組小鼠均保持正常進(jìn)食進(jìn)水，毛色正常，精神狀態(tài)良好。

2.2 黃酒對(duì)便秘小鼠小腸墨汁推進(jìn)率的影響

采用鹽酸洛派丁胺為便秘誘導(dǎo)劑，通過(guò)抑制腸道水分泌[7]和結(jié)腸蠕動(dòng)[8]建立便秘模型。表3結(jié)果顯示，便秘模型對(duì)照組小腸推進(jìn)率與空白對(duì)照組差異極顯著（P＜0.01），表明小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)中便秘模型建立成功。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，高、中、低三個(gè)劑量組與便秘模型組差異不顯著（P≥0.05）。未見(jiàn)黃酒對(duì)便秘小鼠小腸蠕動(dòng)有明顯促進(jìn)作用。

表3 各組小鼠小腸墨汁推進(jìn)率的檢測(cè)結(jié)果Table 3 Determination results of the ink propelling rates of different groups of mice

2.3 黃酒對(duì)便秘小鼠首粒排黑便時(shí)間和糞便質(zhì)量的影響

表4 各組小鼠首粒黑便排出時(shí)間和糞便質(zhì)量的檢測(cè)結(jié)果Table 4 Determination results of the time of discharge of the first black feces and fecalmass of different groups of mice

表4結(jié)果顯示，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，首粒排黑便時(shí)間和糞便質(zhì)量差異極顯著（P＜0.01），表明便秘模型建立成功。高、中、低劑量組與模型對(duì)照組之間差異不顯著（P≥0.05），表明黃酒沒(méi)有明顯通便功能作用。

2.4 黃酒對(duì)便秘小鼠腸道菌群的影響

2.4.1 各試驗(yàn)組小鼠腸道菌群多樣性分析

表5 小鼠腸道菌群α-多樣性統(tǒng)計(jì)分析Table 5 Alpha diversity statistical analysis of intestinal flora in mice

Alpha多樣性（Alphadiversity）是對(duì)單個(gè)樣品中物種多樣性的分析[9]，其中Chao指數(shù)和Ace指數(shù)反應(yīng)樣本的物種豐富度，Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)綜合反應(yīng)群落的多樣性，受樣品群落中物種豐富度和物種均勻度的影響。相同物種豐富度的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，則認(rèn)為群落具有越大的多樣性。由表5可知，在物種多樣性方面，模型對(duì)照組顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），高、中、低劑量組與模型對(duì)照組差異不顯著（P≥0.05），與有關(guān)研究便秘模型腸道菌群α-多樣性分析結(jié)果一致[10]。高劑量組和中劑量組在物種豐富度上顯著高于模型對(duì)照組（P＜0.05）。

2.4.2 各試驗(yàn)組小鼠腸道菌群門(mén)水平變化

腸道菌群按照生理作用可分為三類(lèi)：生理性菌群，主要包括雙歧桿菌、乳桿菌等專(zhuān)性厭氧菌，為腸道優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)腸道正常生理功能起保護(hù)作用；條件致病菌，大腸埃希氏菌、腸球菌、梭菌等，多為專(zhuān)性厭氧菌，僅在滿足特定條件下對(duì)宿主產(chǎn)生影響；病原菌多為變形桿菌等，如在腸道長(zhǎng)期定殖并大量繁殖可導(dǎo)致人體發(fā)病[11-12]。16SrDNA技術(shù)的應(yīng)用，使得DNA測(cè)序更加準(zhǔn)確的分析腸道菌群種類(lèi)及其結(jié)構(gòu)組成[13-14]。

50個(gè)樣品共計(jì)產(chǎn)生683個(gè)OTU，分屬于10個(gè)細(xì)菌門(mén)。各試驗(yàn)組的大部分腸道菌群屬于擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、藍(lán)藻細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）、柔膜菌門(mén)（Tenericutes），見(jiàn)圖1。由圖1可知，造成便秘高、中、低、模型對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，厚壁菌門(mén)顯著降低，降低比例分別為34%、17%、36%、31%。疣微菌門(mén)和藍(lán)藻菌門(mén)顯著增加，疣微菌門(mén)增加比例均100%以上，藍(lán)藻菌門(mén)增加比例分別為59%、84%、52%、43%。

圖1 各組小鼠腸道菌群門(mén)水平豐度圖Fig.1 Phylum-level abundance of intestinal flora in different groups of mice

2.4.3 各試驗(yàn)組小鼠腸道菌群屬水平變化

在屬的水平上，嗜粘蛋白-艾克曼菌屬（Akkermansia）、擬桿菌屬（Bacteroides）、Dorea屬、Odoribacter桿菌屬、顫螺菌屬（Oscillospira）、副桿菌屬（Parabacteroides）、副普雷沃氏菌屬（Paraprevotella）、雷沃氏菌屬（Prevotella）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）含量豐富（＞1%）。高、中、低三個(gè)劑量組與模型對(duì)照組相比擬桿菌屬含量分別降低64%、59%、64%，腸球菌含量分別降低37%、47%、87%，梭菌屬含量分別降低63%、46%、13%，變形桿菌含量分別降低86%、100%、100%；高劑量組嗜粘蛋白-艾克曼菌屬（主要是Akkermansia muciniphila）、乳桿菌屬的含量較模型對(duì)照組分別升高41%、38%。

黃酒中豐富的功能性低聚糖[15]能夠被腸道有益菌吸收，改善微生態(tài)環(huán)境，有利于有益菌的增值，經(jīng)代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸使腸內(nèi)的pH值降低[16]，低pH值環(huán)境能夠調(diào)節(jié)促進(jìn)專(zhuān)性厭氧菌在腸道的定植，使短鏈脂肪酸競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合腸道上皮細(xì)胞或粘膜上受體結(jié)合位，以提高厭氧菌定植抗力[17-18]，抑制腐敗菌的生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)胃腸功能[19]。

已有研究表明，Akkermansia muciniphila是腸道中的一種黏蛋白降解菌[20]，在肥胖及相關(guān)代謝疾病（如糖尿病）中具有關(guān)鍵作用[21]，其組成比例與宿主健康存在正相關(guān)[22]，有望成為新一代的益生菌[23]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)鹽酸洛派丁胺可能引起Akkermansia muciniphila含量增高，而高劑量黃酒也有顯著增加該菌含量的可能性，進(jìn)一步推測(cè)高劑量黃酒組動(dòng)物體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢和該菌含量可能有相關(guān)性，有待深入研究。

圖2 各組小鼠腸道菌群屬水平豐度圖Fig.2 Genus-level abundance of intestinal flora in different groups of mice

3 結(jié)論

黃酒沒(méi)有顯著促進(jìn)BALB/c小鼠小腸蠕動(dòng)，沒(méi)有顯著縮短小鼠首粒排黑便時(shí)間以及提高糞便質(zhì)量，表明黃酒在通便功能上作用不明顯。50.0 mL/（kg·BW）劑量黃酒小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，明顯低于其他各組，該劑量黃酒在維持體質(zhì)量方面具有一定作用。黃酒能夠調(diào)節(jié)便秘小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高菌群豐富度，高劑量黃酒能夠提高嗜粘蛋白-艾克曼菌、乳桿菌的含量，并降低擬桿菌、腸球菌、梭菌和變形桿菌的比例。