板栗大米清酒酒曲選擇及氨基酸含量測定

葛祎楠，鄒 靜*，李 斌，常學東

（1.河北科技師范學院 食品科技學院，河北 昌黎 066600；2.河北省板栗工程技術研究中心，河北 昌黎 066600）

板栗（Castaneamollissima）是我國最早栽培的樹木之一，因為主要生長在山地，因此作為退耕還林的主要樹種，在山地地區廣泛種植，且種植數量逐年上升[1]。板栗除了富含多種營養物質外，還富含淀粉[2-3]。由于板栗極不耐貯存，如果不及時加工，會造成大量的損失。在國外，板栗很少作為食品原料銷售，通過不同的加工方式生產板栗產品，主要有板栗醬、板栗粉、板栗乳、板栗膏、板栗果茶等[4]。而國內板栗主要以食品原料銷售，深加工方法較為單一，產品種類較少，且存在貨架期較短、附加值較低的問題[5]，因此板栗產業中的“豐產不豐收”和“賣栗難”問題日益凸顯[6-7]，這既造成板栗資源的浪費又挫敗了栗農的積極性，因此開發板栗深加工技術成為解決板栗供大于求現狀的根本途徑。

由于板栗富含淀粉又營養豐富，因此可以將其作為釀酒原料。我國幅員遼闊，雖然酒水種類較多，但主要是由啤酒、葡萄酒、黃酒及白酒組成。其中，黃酒的營養價值最高，氨基酸含量豐富[8]，具有活血祛寒[9]、抗衰護心[10]、減肥、補益氣血、抗氧化的功效[11-13]。但由于其獨特的釀造工藝，造就了黃酒的口感厚重、濃郁，影響了黃酒的銷售。而與黃酒相媲美的日本清酒，在口感上卻優于黃酒。雖然清酒的釀造工藝是源于黃酒，但是清酒在釀造過程中，以米曲為糖化曲[14]，并控制大米的碾白精度[15]，因此口感比較清淡、色澤淡黃，比較適合大眾的口味，且極易與菜肴配伍。

本研究以實驗室保藏的4株糖化用米曲霉（Aspergillus oryzae）為曲種，通過測定α-淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶的酶活力以及酒曲的感官評價，篩選一株米曲霉（A.oryzae）作為釀造板栗大米清酒的糖化曲種，參照日本純米清酒工藝制作板栗大米清酒，并對所釀新酒的氨基酸成分進行分析，測定氨基酸種類及含量，為板栗大米清酒實際產業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米：吉林龍羲米業有限公司；燕龍板栗：河北遷安；米曲霉（Aspergillusoryzae）2011、2053、3005以及2038，釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）：本實驗室保藏。

3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：北方試劑有限公司；碘酸鉀（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；酪氨酸（分析純）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

UV5000紫外分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；L530型離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；LXBZX120M型保濕保溫培養箱：力德生物科技（上海）有限公司；L-8900氨基酸自動分析儀：日本日立高新技術公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酒曲的制備[16]

米曲霉斜面制備：按1∶4的比例，將米曲加入水中，55℃糖化3～4 h，然后煮沸過濾，調節糖度為10°Bx，將調節好的米曲汁倒入茄子瓶，添加2%瓊脂，115℃滅菌20 min，取出，冷卻，擺好斜面。無菌條件下，用接種鏟將斜面內的米曲霉點接到茄子瓶斜面中，30℃條件下培養5 d。

酒曲的制備：取大米500 g，用涼開水按照1∶1比例浸泡，直至用手可以輕易將米碾碎時，將大米瀝干，用蒸鍋蒸米，等蒸汽出現8 min后熄火（要求米粒有彈性但不黏手）后攤開晾涼。在無菌條件下，將無菌水倒入米曲霉斜面，充分振蕩后得到孢子液，將孢子液倒入到已經晾涼的米飯當中，攪拌均勻后，30℃條件下恒溫培養，待表面呈現孢子時取出，在50℃烘干，備用。

1.3.2 板栗大米清酒工藝流程及操作要點[17-18]

操作要點：板栗大米清酒釀造時，首先將板栗去殼后分成大米粒大小顆粒。大米與水按1∶2的比例浸泡24 h，瀝干后與板栗混勻。板栗與大米（浸泡前）按1∶9比例混合后進行蒸15 min，晾涼。接曲量為原料質量的10%，拌曲后30℃培養1d接入酵母菌，保溫培養12h后，按1kg原料加入1.41kg水的比例加水，20℃釀造20 d。加水后前7 d每天攪拌2次，7 d后封缸直至20 d，過濾壓榨得到新酒。釀造過程中原料、米曲分3次投入發酵罐中，低溫（20℃）發酵后經過濾除菌后得到新酒。

1.3.3 分析檢測[19-21]

（1）α-淀粉酶活力的測定

采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定米曲中α-淀粉酶活力。

α-淀粉酶活力單位定義：1 g干米曲在60℃、pH 6條件下，1 min從可溶性淀粉中釋放出1μmol還原糖所需的酶量為1個酶活力單位（U/g）。

（2）糖化酶活力的測定

采用次碘酸鉀法測定米曲的糖化酶活力。

糖化酶活力單位定義：1 g干米曲于40℃，pH 4.6條件下，1h分解可溶性淀粉，產生1 mg葡萄糖所需的糖化酶量為1個酶活力單位（U/g）。

（3）蛋白酶活力測定

采用紫外分光光度法測定酸性條件下米曲中的蛋白酶活力。

蛋白酶活力單位定義：1 g干米曲，在40℃、pH 4.5條件下，在1 min內水解酪蛋白產生1μg酪氨酸所需的蛋白酶量為一個酶活力單位（U/g）。

（4）氨基酸含量及種類測定

吸取酒樣10.0 mL，置于50.0 mL容量瓶中，加入5%三氯乙酸20 mL，搖勻，加水稀釋至刻度，搖勻，于微孔漏斗上過濾，吸取濾液，直接裝樣于日立L-8900氨基酸自動分析儀上，測定除色氨酸外的其他氨基酸的含量。

2 結果與分析

2.1 四種米曲霉酒曲感官比較

酒曲被比喻為“酒之骨”，它除了將淀粉分解成單糖外，在賦予酒各種風味方面也起著至關重要的作用。按照1.3.1方法制備4種米曲霉的酒曲，整個培養過程中酒曲感官變化情況見表1。

表1 米曲霉純種接種后4種酒曲感官評價Table 1 Sensory evaluation of 4 kinds of Jiuqu after pure inoculation with Aspergillus oryzae

由表1可知，米曲霉2011成曲后的口感香甜，且香氣明顯。米曲霉2053成曲后米飯易板結，不利于微生物的生長。米曲霉2038和3005的成曲醬香味較濃，會影響發酵后酒液口感。因此從酒曲表觀、口感和氣味等方面對4種米曲霉進行綜合評價，其成曲優劣排序為米曲霉酒曲2011＞2053＞2038＞3005。

2.2 四種米曲霉酒曲酶活力比較

2.2.1 四種米曲霉酒曲α-淀粉酶活力比較

以四種米曲霉為曲種，制備酒曲，培養過程中每隔12h測定一次，四種米曲霉酒曲的α-淀粉酶酶活力測定結果見圖1。

圖1 4種米曲霉酒曲α-淀粉酶酶活力比較Fig.1 Comparison ofα-amylase activities of 4 kinds of Jiuqu after inoculation with Aspergillus oryzae

由圖1可知，隨著培養時間的延長，4種米曲霉酒曲的α-淀粉酶酶活力逐漸增強。其中米曲霉2011的淀粉酶活力最強為1 306.63 U/g，米曲霉2053次之為1 059.16 U/g；而米曲霉2038和米曲霉3005的α-淀粉酶活力相對較弱。

2.2.2 四種米曲霉酒曲糖化酶活力比較

糖化酶活力的高低，決定原料的最終出酒率。四種米曲霉酒曲的糖化酶活力測定結果見圖2。

圖2 4種米曲霉酒曲糖化酶酶活力比較Fig.2 Comparison of glucoamylase activities of 4 kinds of Jiuqu after inoculation with Aspergillus oryzae

由圖2可知，四種米曲霉酒曲的糖化酶活力隨著培養時間的延長而增大。四種米曲霉酒曲中，米曲霉酒曲2053的糖化酶活力最大，培養84 h時，酶活力達到392.2 U/g，米曲霉酒曲2011的糖化酶活力次之，培養84 h時達到峰值為324.56U/g；米曲霉3005和米曲霉2038的糖化酶活力最弱。培養84h分別為140.32 U/g干質量和74.25 U/g。

2.2.3 四種米曲霉酒曲蛋白酶活力比較

酸性環境下，4種米曲霉酒曲的蛋白酶活力，結果見圖3。

圖3 4種米曲霉酒曲蛋白酶酶活力比較Fig.3 Comparison of protease activities of 4 kinds of Jiuqu after inoculation with Aspergillus oryzae

由圖3可知，隨著培養時間的延長，4種米曲霉酒曲的酶活力均逐漸增加。4株霉菌中米曲霉2038酒曲的蛋白酶活力最強，培養到84h時，酶活力達到3262.94U/g，其次為米曲霉3005酒曲。而米曲霉2011和2053酒曲的蛋白酶活力最弱，培養到84 h時，酶活力分別為1 036.33 U/g和1 568.68 U/g。蛋白酶除提高出酒率，縮短發酵周期，有助于香味物質的形成的作用外，還可以降低酒液中雜醇油含量。但研究表明[23]，酸性條件下蛋白酶能阻斷生淀粉對淀粉酶的吸附，并會破壞嗜殺酵母的嗜殺代謝基因，而失去對野生酵母的殺傷力。因此，在釀酒工業需要控制蛋白酶含量，確保蛋白酶含量適中，從而保證淀粉正常分解。

由于酒曲要求具有較強的液化酶活力、糖化酶活力以及一定的酸性蛋白酶活力，因此綜合成品酒曲的口感評價以及3種酶活力，最終選定米曲霉2011為最終的糖化酒曲。

2.3 板栗大米清酒和純大米清酒中氨基酸種類及含量比較

按照日本純米清酒工藝分別釀造板栗大米清酒和純大米清酒，采用氨基酸測定儀分別測定了兩款酒中氨基酸的種類及含量，結果見表2。

由表2可知，兩種清酒中都含有豐富的氨基酸，蛋白質含量是衡量食品營養的重要指標之一，板栗中的蛋白質占5%～11%[24]，高于大米蛋白質含量4.8%～9.1%[25]。因此在原料相同的條件下，添加10%的板栗可以使酒中的氨基酸含量明顯增加。板栗大米清酒中檢測出的17種氨基酸（含8種必需氨基酸）含量均高于大米清酒中的氨基酸含量，其中天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的含量是大米清酒的2倍以上。板栗中的賴氨酸等必需氨基酸的含量超過聯合國糧食及農業組織（food and agricultureorganization of theunited nations，FAO）/世界衛生組織（world health organization，WHO）的標準[26]，同時就豆類和禾谷類中限制氨基酸而言，板栗蛋白可以改善其攝入量不足，完善膳食營養結構。同時適當提高氨基酸含量，有助于改善酒液風味、改良酒質。因此添加板栗既改良了清酒的營養價值，又改善了其風味。

表2 純米清酒和板栗大米清酒中氨基酸的種類及含量比較Table 2 Comparison of the types and contents of amino acids between rice sake and Chinese chestnut-rice sake

3 結論

根據4種米曲霉所制酒曲的感官評價以及對液化酶、糖化酶、酸性蛋白酶活力的分析，最終確定米曲霉2011為板栗大米清酒的糖化曲，其α-淀粉酶活力、糖化酶活力及酸性蛋白酶活力分別為1 306.63 U/g干質量、324.56 U/g干質量、1 036.33 U/g干質量。板栗大米清酒中共檢出17種氨基酸，其中包含8種人體必需氨基酸，板栗的添加使得清酒中氨基酸的含量顯著增加，其中有9種氨基酸（天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）的含量是大米清酒中的2倍以上，板栗適合作為釀酒原料，適當添加板栗不僅可以提高清酒的營養價值，對清酒風味有一定的好處。