白酒釀造廢水制備微生物絮凝劑的研究

周明羅，陳 杰，游 玲，王 濤

（1.宜賓學院 資源與環境工程學院，四川 宜賓 644007；2.宜賓學院 發酵資源與應用四川省高校重點實驗室，四川 宜賓 644007）

微生物絮凝劑是一類具有絮凝活性的微生物代謝產物或分泌物，主要成分為蛋白質、糖蛋白、多糖及脫氧核糖核酸等物質，具有大量的氨基、肽鍵、羥基、芳環等多種活性官能團[1-3]，這些官能團的電性差異能使水中細小顆粒物及膠體態物質吸附、凝聚、沉淀，從而有效去除污水中的懸浮物（suspended solids，SS）及膠體物質。微生物絮凝劑對有機物、濁度、色度、金屬離子等污染物的去除及污泥脫水均有良好效果[4-6]，具有高效、廣譜絮凝、生物可降解、安全無毒、無二次污染等優點，長期以來受到國內外研究者的關注。目前，在絮凝機理、活性成分、絮凝活性微生物來源、應用條件等[7-10]方面都有大量研究。然而，微生物絮凝劑工業化發展緩慢，實際工程應用仍然較少，生產制備成本高是主要限制因素之一。其中，培養基成本約占微生物絮凝劑生產總成本70%[11-12]。因此，探求優良、廉價的培養基，是克服這一瓶頸的有效途徑。

眾多學者研究了以豆腐廢水、啤酒廢水、釀醋廢水、屠宰廢水等作為培養基對產絮凝菌進行培養[13-15]，而以白酒釀造廢水作為廉價培養基還鮮有報道。白酒釀造大多以小麥、高粱、玉米等為原輔料，其生產廢水主要包括黃水、底鍋水等，含有大量蛋白質、糖類、淀粉等含碳、氮有機物[16]，這些含碳、氮物質是微生物生長必需的營養物。本研究從活性污泥中分離產絮菌，以白酒釀造廢水為廉價培養基，可有效降低白酒廢水中的有機物污染物濃度，實現以廢治廢，同時將白酒廢水中含碳、含氮有機物資源化利用以降低微生物絮凝劑的培養成本，為微生物絮凝劑選取廉價培養基提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與廢水

菌種從宜賓市城市污水處理廠周期循環活性污泥法（cyclic activated sludgesystem，CASS）生化池的活性污泥中篩選、分離獲得。

白酒釀造廢水取自宜賓某酒業公司釀造車間黃水及底鍋廢水，主要污染物濃度為總氮（total nitrogen，TN）210.5 mg/L、總磷（total phosphorus，TP）25.6 mg/L、化學需氧量（chemical oxygen demand，COD）20.8 g/L、五日生化需氧量（biochemical oxygen demand，BOD5）10.2 g/L。

1.1.2 試劑及培養基

主要試劑：培養基原料（化學純）、高嶺土、NaOH（分析純）、鹽酸（工業級）等；

富集、分離培養基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10 g，瓊脂12 g（富集培養基中不添加），NaCl 4.0 g，pH=7.0～7.2，加水至1 L，121℃滅菌20 min；

發酵培養基：葡萄糖15g、MgSO40.3g、（NH4）2SO40.3g、酵母膏0.75 g、尿素0.75 g、KH2PO43 g、K2HPO47.5 g、pH 7.1，加水至1 L，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

78HW-1恒溫培養箱、BSD-YXF2200恒溫搖床：上海博訊實業有限公司；SANYO高壓滅菌鍋：SANYO公司；DM 2000光學顯微鏡：德國萊卡公司；Lynx6000離心機：美國thermo公司；PHS-3CpH計：上海雷磁儀器廠；無菌操作臺、TU-1901紫外可見光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；EppendorfAG分子擴增PCR儀：德國Eppendorf公司；Malvern Mastersizer 3000E粒徑分析儀：英國Malvern公司等。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種分離與鑒定

菌株分離：取CASS反應池的混合液2mL，加入98mL富集培養基中，在35.8℃、搖床轉速120 r/min條件下，培養時間24 h后，取發酵培養液用無菌水稀釋1 000倍后，取1 mL接種于分離培養基上，32℃恒溫培養36 h，觀察菌落形態，挑取單菌落，繼續在分離培養基平板劃線純化3次，得到純培養菌株，轉接到分離培養基斜面上，4℃保存備用。

絮凝菌株篩選：將分離純化獲得的菌株，接種到發酵培養基，120 r/min、32℃振蕩培養72 h獲得發酵液，根據發酵液對高嶺土懸濁液的絮凝效果，選出高效的絮凝劑產生菌。

菌株鑒定：根據文獻[17]提供的方法，適當修改。提取培養物基因組DNA后，聚合酶鏈式反應（polymerasechain reaction，PCR）擴增16SrDNA。細菌引物[18]27f：5'-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3'和1541r：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'，PCR反應體系和反應條件參照文獻[17]的方法進行，菌株16Sr DNA測序由上海立菲生物技術有限公司完成，將測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數據庫，通過Blast與模式菌株比對，將其鑒定到種。

1.3.2 微生物絮凝劑的制備

將優選獲得的菌株，在設定條件下培養，獲得的發酵培養液即為微生物絮凝劑，采用單因素法，考察白酒廢水COD、培養時間、初始pH、外加氮源、磷源等因素對絮凝效果的影響，并優化白酒釀造廢水制備微生物絮凝劑的培養條件。

1.3.3 絮凝效果的測定

向100 mL 4 g/L的高嶺土懸濁液中加入5 mL微生物絮凝劑（發酵培養液），于200 mL燒杯中快速攪拌1 min，慢速攪拌3 min，靜置20 min，取上清液用紫外可見分光光度計在波長550 nm處測吸光度值，每次3個平行樣，并按式（1）計算絮凝率（η）。

式中：Ao為原懸濁液吸光度值；A為絮凝后懸濁液吸光度值。

1.3.4 水質及絮體粒徑測定方法

COD的測定采用HJ/T 399—2007《水質化學需氧量的測定快速消解分光光度法》；BOD5的測定采用HJ 505—2009《水質五日生化需氧量的測定稀釋與接種法》；NH3-N的測定采用HJ535—2009《水質氨氮的測定納氏試劑分光光度法》；總氮的測定：采用HJ 636—2012《水質總氮的測定》中的過硫酸鉀消解法；總磷的測定：采用HJ671—2013《水質總磷的測定》中的鉬酸銨法。

污水中絮體粒徑用Malvern Mastersizer 3000E粒徑分析儀測定，D10表示絮體顆粒的累積含量為10%時對應的絮體粒徑，其值越小反映細微顆粒越多；D90表示絮體顆粒的累積含量為90%時對應的絮體粒徑，其值越大反映大顆粒越多。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選與鑒定結果

2.1.1 菌株的篩選

圖1 不同菌株的絮凝效果Fig.1 Flocculation effect of different strains

共篩選到12株產絮菌，依次編號為HN1～HN12。在發酵培養基中在溫度32℃、轉速120 r/min條件下，培養48 h，并對發酵液的絮凝效果進行測定，結果見圖1。分析絮凝率可知，產絮菌HN2、HN5培養發酵液絮凝效果較好，絮凝率分別為69.3%、76.1%。為此，選擇絮凝率最高的產絮菌HN5為實驗菌株。

2.1.2 菌株鑒定

絮凝效果最好的產絮菌HN5顏色呈乳白色、邊緣整潔、表面濕潤、微凸、單菌落直徑2 mm左右，革蘭氏陰性；其16SrDNA序列比對結果見表1。由表1可知，菌株HN5 16S rDNA序列與Ochrobactrum pseudintermedium ADV31（Genbank no.NR043756.1）的相似度最高，為99%，與其余種屬的相似性均低于97%。故將HN5菌株初步鑒定為假中間蒼白桿菌（Ochrobactrumpseudintermedium）。該種屬細菌廣泛分布于活性污泥環境，如王麗[19]從活性污泥中分離獲得蒼白桿菌（Ochrobactrum sp.）、蘇峰等[20]從生活污水站曝氣池活性污泥中分離獲得Ochrobactrum sp.Azn6.1產絮菌。

表1 菌株HN5的16S rDNA系列比對結果Table 1 Alignment results of 16S rDNA sequence of strain HN5

2.2 白酒廢水制備微生物絮凝劑的條件

2.2.1 廢水COD對絮凝效果的影響

將白酒廢水（COD 20.8 g/L）分別稀釋2、3、4、5、6、8倍作為發酵培養基，以菌株HN5預發酵液按2%接種量接入，在32℃、轉速120 r/min條件下，恒溫培養60 h，考察不同COD濃度對絮凝效果的影響，結果如圖2所示。當白酒廢水COD為4.2～6.9 g/L時，絮凝率在70.4%以上，其中效果最好為78.4%，此時稀釋倍數為4，COD為5.2 g/L。COD濃度太高時有機碳源負荷過高或COD濃度過低時碳源等營養物質不夠，都不利于微生物生長并抑制多糖類物質的分泌，而多糖物質是微生物絮凝劑的主要成分[4，21]。

圖2 不同COD對絮凝效果的影響Fig.2 Effect of different COD on flocculation

2.2.2 培養時間對絮凝效果的影響

在白酒廢水COD 5.2 g/L、32℃、120 r/min培養條件下，考察不同培養時間對絮凝效果的影響，結果如圖3所示。隨著培養時間增加，絮凝率先增大后減小，培養時間在60 h、72 h、84h時絮凝率分別為78.8%、80.1%、74.2%，在72 h時絮凝率最高，隨著培養時間的增大，發酵液中營養物質逐漸消耗，菌體細胞的代謝方向發生變化，粘性有機大分子代謝產物減少，使得微生物絮凝劑活性減弱。因此，發酵培養時間在60～72 h為宜。

圖3 不同時間對絮凝效果的影響Fig.3 Effect of different time on flocculation

2.2.3 培養pH對絮凝效果的影響

圖4 不同pH對絮凝效果的影響Fig.4 Effect of different pH on flocculation

在白酒廢水COD 5.2 g/L、32 ℃、120 r/min條件下，培養60 h后，用HCl和NaOH溶液，調節培養基初始pH值，考察不同pH對絮凝效果的影響，結果如圖4所示。結果表明，廢水pH值為6、7、8時絮凝效果較好，絮凝率達到72.1%以上，即在弱酸性、中性、弱堿性條件下的絮凝效果較好。原因是培養液pH值會影響氧化還原電位的大小以及有機物的離子化作用，從而影響微生物對營養物質的吸收利用和絮凝物質的分泌；同時生物酶只能在一定pH值下才能發揮高活性，pH值過高或過低都將降低酶的活性。

2.2.4 外加營養物質對絮凝效果的影響

白酒廢水COD 5.2 g/L，pH調整為7.0±0.1，在32℃、120 r/min條件下，添加不同量的（NH4）2SO4、KH2PO4，培養60 h，考察不同外加氮、磷量對絮凝效果的影響，結果如圖5所示。由圖5可知，隨著（NH4）2SO4量的增大，絮凝效果變化甚微，說明白酒廢水中有足夠氮源供微生物所需，不需要外加氮源；隨著KH2PO4的添加量增大，絮凝率逐漸變大，當添加量增大到2.0 g/L以后，繼續增大投加量，絮凝率增大不明顯，KH2PO4的適宜添加量為2.0 g/L。

圖5 外加物質對絮凝效果的影響Fig.5 Effect of additional nutrient on flocculation

2.3 對生活污水的處理效果

在白酒廢水COD 5.2 g/L、KH2PO42.0 g/L、培養基初始pH值7.0±0.1、32℃、120 r/min條件下，培養60 h后，向100 mL生活污水中加入不同體積發酵培養液，其絮凝效果及對COD、懸浮物（SS）、氨氮（NH3-N）去除率結果如圖6所示，絮凝率最高時污水中絮體粒徑如圖7所示。

由圖6可知，HN5產絮菌發酵培養液對生活污水絮凝和SS去除有很好的效果，并且隨著發酵液投加量的增加，其去除率先增大后減少，絮凝劑投加量為6 mL/100 mL時，絮凝效果最高為86.8%、SS去除率高達92.5%。COD的去除率低于SS的去除率；隨著發酵液投加量的增加，NH3-N去除率未出現規律性增加，且去除率均低于20%。這是因為生活污水中有大量溶解性COD，以及污水中NH3-N為溶解性的，而絮凝對溶解性物質沒有顯著去除效果。SS的高去除率和高絮凝效果，說明微生物絮凝劑對膠體、懸浮物形成絮體起到了正效應，能有效加強懸浮物、膠體物及微生物絮凝劑之間的相互作用，促進架橋聯接和大顆粒絮體形成進而增強絮凝效果；但隨著絮凝劑投加量的進一步增加，會在水中形成反電位而使絮凝效果下降[7，22]。由圖7可知，加入了微生物絮凝劑的污水D10較小，說明細微顆粒所占的比例高于空白污水；投加絮凝劑后，污水D90對應的粒徑開始時大于未投加絮凝劑的污水，沉降一定時間后，小于空白污水，說明加入絮凝劑后，促進了絮體的形成，且生活污水中形成的絮體顆粒易于沉降，進而表明菌株HN5產生的絮凝劑適宜于生活污水的絮凝處理，能有效去除懸浮物。

圖6 菌株發酵培養液對生活污水處理的效果Fig.6 Effect of fermentation medium on domestic sewage treatment

圖7 生活污水中絮體粒徑Fig.7 Flocs size in domestic sewage

3 結論

從活性污泥中分離獲得的產絮菌HN5，經鑒定為假中間蒼白桿菌（Ochrobactrum pseudintermedium），培養產生的發酵液具有較好的絮凝效果，對高嶺土懸濁液絮凝率最高可達84.9%。

利用白酒釀造廢水作為替代培養基，產絮菌HN5發酵液仍具有較高的絮凝率，影響其絮凝效果的主要因素包括白酒釀造廢水COD、培養時間、培養基pH值、外加磷源；適宜的培養條件為COD 5.0～6.9 g/L，培養時間60～72 h，pH值6～8，KH2PO42.0 g/L。

用產絮菌HN5發酵液處理生活污水，當絮凝劑投加量為6.0 mL/100 mL時，效果最好，絮凝率達到86.8%、SS去除率高達92.5%。白酒釀造廢水用于產絮凝菌的培養，微生物絮凝劑具有較高的絮凝效果。