去泛素化酶USP13與抑癌蛋白Merlin的相互作用

徐 靜，王 星，陳大虎*

（江蘇師范大學 生命科學學院，江蘇 徐州 221116）

神經纖維瘤病Ⅱ型（neurofibromatosistype 2，NF2）是重要的抑癌基因，其編碼的Merlin蛋白表達水平的變化與腫瘤的發生密切相關。抑癌蛋白Merlin是一種細胞結構蛋白，在細胞膜和細胞骨架之間起著連接的作用[1]。NF2基因缺失、突變或被抑制將造成Merlin蛋白缺失與失活，引起細胞失控性增殖，最終導致腫瘤的形成[2-3]。Merlin蛋白可以調控細胞增殖、運動[4]，與生長發育、早期胚胎發育[5]存在很大關聯性[6]，對抑制腫瘤細胞遷移和侵襲起到重要作用[7-8]。因此，NF2基因介導的腫瘤發生及Merlin蛋白的功能的研究具有十分重要的意義。Merlin蛋白的構象和活性受翻譯后加工修飾，研究表明，Merlin蛋白可以被泛素化[9]，從而促進底物蛋白的降解過程。但對其去泛素化的研究卻比較少。去泛素化是泛素化的一個相反過程，通過去除單泛素或多聚泛素分子可以穩定底物蛋白水平[10]，與細胞增殖、細胞凋亡等生命活動密切相關[11]。在體內，蛋白質泛素化與去泛素化形成動態平衡，調節機體的蛋白質功能、代謝，影響細胞周期、細胞分化、免疫等[12]。

泛素特異性蛋白酶13（ubiquitin-specific peptidase 13，USP13）是去泛素化酶（deubiquitinases，DUBs）中泛素特異性蛋白酶（ubiquitin-specific proteases，USPs）家族中的一員，也是半胱氨酸依賴蛋白酶超家族成員之一[13]。去泛素化酶USP13通過裂解賴氨酸48（lysine 48，K48）連接的多聚泛素鏈，使泛素分子從底物蛋白中分離，從而逆轉因泛素化引起的底物蛋白的降解[14-15]。已有研究表明，USP13可以通過直接與抑癌蛋白第10號染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白（phosphateand tensionhomology deleted onchromsometen，PTEN）結合并使其去泛素化[16]來穩定PTEN的蛋白水平，其通過調節PTEN抑制了腫瘤形成和糖酵解過程[17-18]。Merlin蛋白作為一個已知的抑癌蛋白，而且是第一個被發現具有腫瘤抑制作用的蛋白質[19]，為研究Merlin蛋白是否與去泛素化酶USP13之間存在類似的關系并且受USP13的調節。本研究通過構建MYC-tagged Merlin與FLAG-tagged USP13表達載體，采用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）和蛋白質印跡法（western blot，WB）等方法初步研究去泛素化酶USP13和抑癌蛋白Merlin之間的關系。為進一步研究去泛素化酶USP13對抑癌蛋白Merlin的調節作用奠定了基礎，為腫瘤的發生、發展提供了相關線索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細胞與質粒

293T細胞：江蘇師范大學生命科學學院腫瘤分子生物學實驗室；Trans5α感受態細胞：北京全式金生物技術有限公司；質粒pCMV-3Tag-6（FLAGtag）、pCMV-3Tag-7（MYC tag）：美國安捷倫科技有限公司。

1.1.2 培養基

LB液體培養基、LB固體培養基：生工生物工程（上海）股份有限公司；杜爾伯科改良伊格爾培養基（dulbecco's modified eaglemedium，DMEM）：美國Hyclone公司。

1.1.3 試劑

酶切buffer、BamHⅠ（5000U/mL）、EcoRⅤ（2000U/mL）、XhoⅠ（2 500 U/mL）、HindⅢ（5 000 U/mL）限制性核酸內切酶、T4連接酶（10000U/mL）、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）純化試劑盒、Trypsin胰蛋白酶、Anti-c-MYCMouse抗體、Anti-FLAG Rabbit抗體、Anti-Rabbit IgG HRP、Anti-Mouse IgG HRP、胎牛血清：北京全式金生物技術有限公司；三磷酸脫氧核糖核苷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTPs）：北京索萊寶科技有限公司；1 kbp蛋白Marker：寶日醫生物技術（北京）有限公司；氨芐青霉素、Goldview染料：南京金斯瑞生物科技有限公司；protein G agerose珠子、Pierce蛋白酶和磷酸酶抑制劑片劑：美國Thermo Fisher Scientific公司；熒光顯影液：美國BIO-RAD公司；Q5高保真DNA聚合酶（5 000 U/mL）：美國NEB公司。

1.2 儀器與設備

DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠；MB-102振蕩型恒溫金屬浴：杭州博日科技有限公司；Centrifuge 5424 R高速冷凍離心機、Mastercycler nexus聚合酶鏈式反應（polymerasechain reaction，PCR）儀：艾本德（中國）有限公司；SW-CJ-1FB單人超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；OPTIMAX型X射線膠片洗片機：德國布魯泰克有限公司；TL-4熒光倒置顯微鏡：中國OLYMPUS公司；Thermo 371細胞培養箱、Thermo 1389型超凈工作臺：美國Thermo Fisher Scientific公司；Gel Doc XR凝膠成像系統：美國BIO-RAD公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；LRH-70生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 NF2基因和USP13基因的調取

以Trizol法提取的293T細胞總RNA為模板，采用反轉錄試劑盒反轉錄得到cDNA。以cDNA為模板，PCR擴增NF2基因、USP13基因的全長。NF2基因的上游引物為5′-ATTAGGATCCATGGCCGGGGCCATCGCTTCC-3′，下游引物為5′-ATGCGATATCAATGCAGATAGGTCTTCTGCCT-3′。USP13基因的上游引物為5′-ATTAAAGCTTATGCAGCGCCGGGGCGCCCTGTT-3′，下游引物為5′-TAGCCTCGAGGCTTGGTATCCTGCGGTAAAA-3′。PCR擴增體系：上游引物、下游引物（10μmol/L）各1.25μL，模板1μL，5×Q5buffer 5μL，Q5高保真DNA聚合酶0.5μL，dNTPs（10 mmol/L）0.5μL；雙蒸水（ddH2O）15.5μL。PCR擴增條件：98℃預變性30 s；98℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸1 min 30 s，39個循環；72℃再延伸2 min。采用1%的瓊脂糖凝膠對PCR擴增產物進行電泳檢測。

1.3.2 表達載體的構建及鑒定

NF2基因表達載體NF2/pCMV-3Tag-7的構建及鑒定：NF2基因的PCR擴增產物與質粒pCMV-3Tag-7分別經核酸內切酶（BamHⅠ、EcoRⅤ）雙酶切、純化獲得帶有粘性末端的NF2基因與載體pCMV-3Tag-7，NF2基因與載體pCMV-3Tag-7在16℃條件下過夜連接得到表達載體NF2/pCMV-3Tag-7后轉化至Trans5a感受態細胞。感受態細胞涂布于含50mg/mL氨芐青霉素的LB固體培養基上，只有當重組質粒或者原始質粒成功轉化到感受態細胞，感受態細胞才能在含氨芐青霉素的LB固體培養基上形成克隆。然后對陽性克隆進行酶切鑒定并送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

USP13基因表達載體USP13/pCMV-3Tag-6的構建及鑒定：方法同NF2基因表達載體的構建及鑒定，所用載體為pCMV-3Tag-6，所用限制性核酸內切酶為XhoⅠ、HindⅢ。1.3.3 NF2基因、USP13基因表達載體的蛋白表達

轉染：利用陽離子聚合物基因轉染技術[20]，轉染試劑為聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI），將表達載體NF2/pCMV-3Tag-7和USP13/pCMV-3Tag-6分別轉染到293T細胞中。具體操作：用500μL無血清培養基DMEM與PEI、表達載體混合，PEI與表達載體的比例為3μL∶1μg，室溫放置30 min。同時，用無血清培養基DMEM替換293T細胞培養皿中的完全培養基。將混合液均勻滴入293T細胞培養皿中，37℃培養5 h后用完全培養基替換，繼續培養48～72 h。

蛋白提取：用4℃預冷的磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffer saline，PBS）洗滌細胞，用細胞刮刀刮下細胞，混合液經2 500 r/min離心2 min，棄上清，收集細胞。加入60～100μL RIPA裂解液（每15 mL加一片蛋白酶抑制劑）裂解細胞，冰上孵育15～30 min，4℃離心10 000～14 000 r/min，取上清，獲得細胞總蛋白。其中RIPA裂解液：10 mmol/L Tris（pH 7.4）、150 mmol/L NaCl、1%脫氧膽酸鈉、0.1%十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）、1%乙基苯基聚乙二醇（nonidet p 40，NP-40）。

十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）：取60μL細胞蛋白提取液，加入12μL 5×蛋白上樣緩沖液，100℃變性8 min后進行SDS-PAGE電泳，蛋白上樣量為10～20μL。

WB：轉聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidenefluoride，PVDF）的條件是250 mA、2h。用5%的脫脂牛奶對膜進行封閉2h以上。分別加Anti-FLAGRabbit抗體（檢測USP13）或Anti-c-MYCMouse抗體（檢測Merlin）4℃過夜，抗體與脫脂牛奶體積比為1μL∶3 000μL，加辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的二抗，二抗與脫脂牛奶體積為1μL∶5 000μL。經洗膜、顯影液化學發光，最后用OPTIMAX X光洗片機對膜進行曝光洗片，并記錄結果。其中5%的脫脂牛奶由0.15 mol/L磷酸鹽緩沖液-0.4%吐溫20（phosphate buffer solution-tween-20，PBS-T）配制。

1.3.4 免疫共沉淀驗證Merlin與USP13相互作用

按照方法1.3.3，將表達載體NF2/pCMV-3Tag-7和USP13/pCMV-3Tag-6共轉染到293T細胞中，培養48～72 h后收取細胞，用100～200μL RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑）裂解細胞，獲得細胞蛋白，獲得的蛋白提取液一部分進行Input試驗，檢測共轉染的重組質粒表達情況。Input表達良好后，進行Co-IP。Co-IP條件：取5μL對應抗體于蛋白提取液中，在旋轉儀上4℃旋轉1～2h，加入30～50μLprotein Gagerose珠子，4℃旋轉過夜，用IPBuffer洗珠子3～5次，100℃煮樣品6～8min。然后進行WB檢測，并對結果進行記錄及分析。

2 結果與分析

2.1 NF2基因和USP13基因的調取結果

NF2基因與USP13基因的PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1。

圖1 NF2基因（a）和USP13基因（b）的PCR擴增產物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplification products of NF2 gene(a)and USP13 gene(b)

由圖1a可知，堿基長度在1 650～2 000 bp范圍內有明顯的目的條帶，NF2基因的片段約為1 700 bp。由圖1b可知，堿基長度在2 000～3 000 bp范圍內有明顯的目的條帶，USP13基因的片段約為2 500 bp，表明NF2基因和USP13基因調取成功。

2.2 表達載體的構建及鑒定結果

從含氨芐青霉素的LB固體培養基上挑取陽性克隆子進行酶切鑒定，表達載體NF2/pCMV-3Tag-7用BamHⅠ、EcoRⅤ進行雙酶切，USP13/pCMV-3Tag-6用XhoⅠ、HindⅢ進行雙酶切。結果見圖2。

圖2 表達載體NF2/pCMV-3Tag-7（a）與USP13/pCMV-3Tag-6（b）的鑒定Fig.2 Identification of expression vectors NF2/pCMV-3Tag-7(a)and USP13/pCMV-3Tag-6(b)

由圖2可知，表達載體NF2/pCMV-3Tag-7及USP13/pCMV-3Tag-6經雙酶切后，載體和目的片段分開，與Marker對比，目的片段大小正確，表明兩個表達載體構建完成。

2.3 蛋白表達的檢測

Merlin蛋白表達的檢測：將NF2/pCMV-3Tag-7表達載體轉染至293T細胞，培養48～72 h后裂解細胞收集蛋白，采用鼠抗MYC進行WB檢測，結果見圖3。

圖3 Merlin蛋白表達的WB檢測結果Fig.3 Determination results of expression of the Merlin protein by WB

由圖3可知，從內參蛋白β-Actin可以看出，兩個樣品上樣量基本相同。轉入表達載體NF2/pCMV-3Tag-7的細胞表達的蛋白在相應的分子質量大小處有明顯的目的條帶，而轉入載體pCMV-3Tag-7的細胞表達的蛋白無目的條帶，表明構建的表達載體在293T細胞中有效表達Merlin蛋白。

去泛素化酶USP13表達的檢測：將USP13/pCMV-3Tag-6表達載體轉染至293T細胞，培養48～72 h后裂解細胞收集蛋白，用兔抗FLAG進行WB檢測，結果見圖4。

圖4 去泛素化酶USP13蛋白表達的WB檢測結果Fig.4 Determination results of expression of the deubiquitinase USP13 protein by WB

由圖4可知，轉入表達載體USP13/pCMV-3Tag-6的細胞表達的蛋白在相應的分子質量大小處有明顯的條帶，而轉入載體pCMV-3Tag-6的細胞表達的蛋白在對應位置無條帶，表明構建的表達載體在293T細胞中有效表達去泛素化酶USP13。與內參蛋白相比較，去泛素化酶USP13在293T細胞中的表達量相對較高。

2.4 Merlin蛋白與USP13蛋白的相互作用

Co-IP是一種檢測蛋白質之間相互作用的有效方法。目前，免疫共沉淀廣泛應用于研究生理條件下蛋白質間的相互作用。為檢測Merlin蛋白與去泛素化酶USP13是否存在相互作用的關系。將表達載體NF2/pCMV-3Tag-7和USP13/pCMV-3Tag-6共轉染到293T細胞中，收集蛋白后，用鼠抗MYC對Merlin蛋白進行Co-IP實驗，用兔抗FLAG對Merlin蛋白做WB檢測，結果見圖5。

由圖5可知，鼠抗MYC將MYC-Merlin蛋白沉淀下來的同時，經WB可檢測到FLAG-USP13蛋白，而加入無關抗體IgG的體系中未檢測到FLAG-USP13蛋白，說明Merlin蛋白與去泛素化酶USP13在細胞內可以相互作用。

為了進一步探討及驗證Merlin蛋白與去泛素化酶USP13相互作用的特異性與真實性，因此，采用用兔抗FLAG對去泛素化酶USP13做Co-IP實驗，用鼠抗MYC對Merlin蛋白進行WB檢測，結果見圖6。

從圖6可以看出，三組樣品的Merlin蛋白與去泛素化酶USP13均表達良好，表明這兩個蛋白在293T細胞中共表達。同樣，兔抗FLAG對去泛素化酶USP13做Co-IP時，WB檢測到MYC-Merlin蛋白的表達，IgG作為無關抗體時未檢測到MYC-Merlin蛋白，說明Merlin蛋白與去泛素化酶USP13之間確實存在特異地相互作用關系。

圖5 Merlin蛋白與去泛素化酶USP13的免疫共沉淀正方向結果Fig.5 Positive results of Co-IP of the Merlin protein and the deubiquitinase USP13

圖6 Merlin蛋白與去泛素化酶USP13的免疫共沉淀反方向結果Fig.6 Negative results of Co-IP of the Merlin protein and the deubiquitinase USP13

3 結論

本研究從293T細胞中成功調取NF2及USP13基因，構建表達載體NF2/pCMV-3Tag-7和USP13/pCMV-3Tag-6后共同轉染至293T細胞中進行表達，證明Merlin蛋白與去泛素化酶USP13之間具有相互作用。去泛素化酶USP13是否對Merlin蛋白在細胞中的表達水平有所影響有待后期的進一步研究。后期還需確定去泛素化酶USP13與Merlin蛋白的調節關系，以及這兩個蛋白相互作用的功能域，并了解其對腫瘤細胞的功能性影響。這兩種基因與人類腫瘤的發生發展都密切相關，此研究為進一步研究Merlin蛋白與去泛素化酶USP13之間的調節關系及其在腫瘤中的有關作用提供了參考，對于揭示抑癌蛋白Merlin的功能具有生物學意義。