鷹嘴豆蛋白酶解動力學研究

葉健明，石寧蕙，周建中，楊海燕*

（新疆農(nóng)業(yè)大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

鷹嘴豆（chickpea）是世界第二大消費豆類，產(chǎn)量居世界豆類第三，是目前世界上栽培面積較廣的食用豆類作物之一[1]。目前，中國對鷹嘴豆的食用以干制和鮮食為主，對鷹嘴豆蛋白的利用較少。鷹嘴豆蛋白富含人體所需的18種氨基酸，且必需氨基酸種類齊全、組成均衡[2-3]，NEWMANCW等[4]研究發(fā)現(xiàn)，鷹嘴豆蛋白的功效比值在2.8左右，消化率79%～88%，與大豆蛋白相似，是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白。應用蛋白酶水解蛋白質(zhì)，可有效增強原料蛋白的生理功效，提高人體吸收。近年來，研究者依靠酶解技術(shù)從多種蛋白原料中獲得降血壓[5-6]、降血脂[7-8]、抗氧化活性[9-10]的小肽產(chǎn)物。生物活性肽的獲得離不開對酶促反應進程的研究，研究其酶解動力學可有效控制酶解過程，進而提高生物活性肽得率，控制酶解成本。

植物蛋白酶解動力學的研究主要集中在蕎麥蛋白[11]、小麥面筋蛋白[12]、豌豆分離蛋白[13]、大豆蛋白[14]、青稞蛋白質(zhì)[15]。而鷹嘴豆蛋白酶解動力學鮮有報道，為了得到鷹嘴豆蛋白酶解最優(yōu)的條件，更好地擬合實際生產(chǎn)條件，使其最大限度發(fā)揮酶促反應的高效性，了解酶促反應的作用機理[16-17]，需要對酶促反應的速率進行研究，因此，研究鷹嘴豆蛋白的酶解動力學具有重要的理論研究和實際應用價值。試驗以堿溶酸沉提取的鷹嘴豆蛋白為原料，從酶解反應機理出發(fā)，結(jié)合數(shù)學模型的擬合和驗證，建立鷹嘴豆蛋白的酶解反應動力學模型，模擬反應進程，旨在為鷹嘴豆生物活性肽的酶解制備提供可量化的、準確的控制方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鷹嘴豆：木壘縣鷹哥生物科技有限公司；鷹嘴豆蛋白：實驗室自制；石油醚（沸點30～60℃）：天津市致遠化學試劑有限公司；堿性蛋白酶（Alcalase2.4L，酶活2.65×105U/g）：丹麥Novozymes公司；牛血清蛋白、福林-酚試劑：北京市索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1200型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；AL204天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TDL-5-A離心機：上海安亭科學儀器廠；FW-100高速萬能粉碎機：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；PHS-3CPH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；CHRIST凍干機ALPHA 1-2LDPlus：北京五洲東方科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鷹嘴豆蛋白的制備

脫脂鷹嘴豆粉（石油醚脫脂，萬能粉碎機粉碎，過80目篩）→堿溶（料液比1∶10（g∶mL）、30 ℃、90 min、pH 10.0）→離心（3 500 r/min，25 min）→上層清液→酸沉（pH4.5）→離心（4 000 r/min，10 min）→真空冷凍干燥[18]。

1.3.2 鷹嘴豆蛋白酶解反應

鷹嘴豆蛋白與水按一定比例（g∶mL）混合均勻，水浴鍋中90℃預處理10 min，冷卻后加0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)至酶解最適pH，55℃攪拌至pH穩(wěn)定后加入酶水解，反應結(jié)束后90℃滅酶10 min，在4 000 r/min條件下離心10 min，取上清液放入冰箱冷藏備用。

1.3.3 酶活力測定

酶活力的測定采用改進的Folin-酚法[19]。

稱取堿性蛋白酶1.0 g，然后用硼酸緩沖溶液（pH=10.5）溶解并稀釋到一定濃度，加入1 mL（10.0 g/L）酪蛋白溶液于40℃下反應10 min，加入2 mL三氯乙酸溶液（65.4 g/L）終止反應。取1 mL上層清液，加入5.0 mL（42.4 g/L）Na2CO3溶液混合均勻后加入1 mL福林酚試劑（福林酚與水體積比1∶2配制）。在波長680 nm處測定吸光度值。

1.3.4 水解度的測定

水解度（degree of hydrolysis，DH）的測定采用pH-Stat法[20]。計算公式如下：

式中：DH為水解度，%；B為堿液體積，mL；Nb為堿液當量濃度，mol/L；?為氨基的解離度；Mp為底物中蛋白質(zhì)總量，g；Htot為底物中蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù)，mmol/g。（鷹嘴豆蛋白Htot=7.22）。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解反應機理和動力學模型的推導

蛋白質(zhì)酶法水解反應符合雙底物順序反應機理[21-23]。

由Henri中間復合物學說可得（1）、（2），式中：E為堿性蛋白酶；S為底物；ES為復合物；P為產(chǎn)物；k1，k-1為速度常數(shù)。

在水溶液中，第二步反應為限速步驟，并且逆過程可忽略。由酶促水解反應速率決定其不可逆反應階段的速率，應速率用R來表示，S0代表初始底物濃度，可得

酶解反應過程中，產(chǎn)物和底物的抑制可導致蛋白酶在酶解過程中失活，失活機制如（4）所示（其中Ea表示具有活力的蛋白酶，Ei表示鈍化的蛋白酶，kd為抑制常數(shù)）

則上述反應過程的動力學方程式為（e表示總蛋白酶）

將方程（3）與方程（5）相除，可得到方程（6）

蛋白酶在水解體系中以游離狀態(tài)E和復合物ES的形式存在，游離狀態(tài)和復合物的和應當是總蛋白酶。因此得到方程（7）

根據(jù)Briggs-Haldane假設(shè)：實際上，許多酶的催化常數(shù)很高，即ES分解為產(chǎn)物這個過程對酶反應速度的影響不能忽略[24-25]。

穩(wěn)態(tài)通常在反應初期的數(shù)毫秒內(nèi)建立，當反應進行一段時間后，可認為ES的生成速度和分解速度相同，這一假設(shè)對大多數(shù)酶促反應是合理的。當反應體系中酶與酶底復合物濃度保持不變時，則有產(chǎn)生的復合物與分解的復合物相等，對于反應（1）根據(jù)假設(shè)可有：

由（9）可得

將方程（9）代入方程（7），因為底物濃度遠高于酶濃度，可認為 S ≈s0，則可得到方程（11）

米氏常數(shù)（Km）可以判斷酶的專一性和天然底物，Km表示酶和底物之間的親和能力，Km值越小，即達到最大酶促反應速度一半所需要的底物濃度越小，親和能力越強，反之亦然。酶活性測定體系中一般保證Km＜＜s0，公式（11）可以簡化為：

把方程（12）代入方程（6），可得：

對公式（13）兩邊進行積分，水解度的積分上限值為DH，下限值為0，總酶量的積分上限值為e，下限值為e0，其積分方程為：

對（14）兩邊進行積分可得：

將（15）簡化：

通過整理方程（3）、（9）、（12）和（16），得到

方程（16）代入方程（3），則可得方程（18）

設(shè)定：

由方程（19）可知，a的大小只與酶解體系初始底物濃度和初始蛋白酶濃度有關(guān)；在恒溫水解反應中，b的大小應為一個常數(shù)。則得蛋白質(zhì)酶解過程中水解速率的動力學模型：

由方程（19）可知，由于k2只與水解溫度有關(guān)，在恒溫水解反應中k2為定值，a的大小隨著初始底物濃度的上升而減小，隨著初始蛋白酶濃度的上升而增大；b的大小與初始底物濃度和初始蛋白酶濃度無關(guān)，但與水解溫度的高低有關(guān)，在恒溫水解反應中，b的大小應為一個常數(shù)，當a為負值時，其水解速率也為負，此時鷹嘴豆蛋白無法水解[15，26]。

對方程（20）積分可得水解度與水解時間的關(guān)系方程式如下：

2.2 酶解動力學參數(shù)的確定

通過研究不同初始底物濃度和初始蛋白酶濃度對水解度的影響，來確定動力學模型中的參數(shù)。以鷹嘴豆蛋白為底物進行水解，確定初始酶解條件為：底物濃度4%，時間120 min，pH 8.0，溫度55 ℃，酶添加量4 000 U/g，在此基礎(chǔ)之上考察不同底物濃度2%（20 g/L）、4%（40 g/L）、6%（60 g/L）、8%（80 g/L）、10%（100 g/L）和酶添加量2 000 U/g（0.30 g/L）、3 000 U/g（0.45 g/L）、4 000 U/g（0.60 g/L）、5 000 U/g（0.75 g/L）、6 000 U/g（0.90 g/L）對水解度的影響。試驗結(jié)果如圖1，圖2所示。

由圖1，圖2可知，在固定初始底物濃度和酶濃度的條件下，鷹嘴豆蛋白水解度隨酶解時間的增加而升高，而酶解速率逐漸降低，其原因可能是隨酶解時間的增加，底物中的蛋白質(zhì)易被水解的肽鍵數(shù)量減少和酶活降低[27]。當酶解時間達到60 min后，增速放緩，這可能與酶解體系中的pH改變和底物抑制有關(guān)[27]，同時蛋白酶活力會隨水解時間增加而降低，相同水解時間條件下，高底物濃度水解液的水解度要低于低底物濃度的水解度，且底物質(zhì)量濃度較高時，酶失活速率較快。

圖1 初始底物濃度對水解度的影響Fig.1 Effect of original substrate concentration on the hydrolysis degree

圖2 初始酶濃度對水解度的影響Fig.2 Effect of original enzyme concentration on the hydrolysis degree

將圖1，圖2的試驗結(jié)果代入公式（21）進行非線性擬合，得到不同初始底物濃度（S0）和初始酶濃度（E0）所對應的動力學參數(shù)a與b，結(jié)果見表1所示。

表1 酶解動力學參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of enzymatic hydrolysis

由表1可知，參數(shù)a隨著初始底物濃度的增加而減小，隨著初始蛋白酶濃度的增大而增大。動力學參數(shù)b不受初始底物濃度和酶濃度的影響，其數(shù)值在一個狹窄的范圍里波動，幾乎接近一個常數(shù)，這分別與已有報道大米蛋白[28]和蕎麥蛋白[11]的酶解動力學參數(shù)b值的變化趨勢一致。因而在本研究中，鷹嘴豆蛋白的酶解動力學參數(shù)b值用其平均值0.148表示，這與模型推導所得結(jié)論一致。

2.3 酶解反應速率常數(shù)的確定

為了得到酶解反應速率常數(shù)k2，以a為縱坐標，E0/S0值為橫坐標作圖，并驗證方程的擬合情況，結(jié)果如圖3所示。

圖3 a值隨著不同的E0/S0值的變化趨勢Fig.3 Change trend of a value with different E0/S0 values

從圖3所得到的線性關(guān)系式，y=39.522x-0.080 4，R2=0.984 0，可知a值隨著E0/S0值關(guān)系曲線所對應的方程（22）：

酶解反應速率常數(shù)k2=39.522 min-1，水解速率的動力學模型：

水解度的動力學模型：

由動力學模型（23），（24）可知，水解速率隨著初始蛋白酶濃度的增加而上升，但隨著初始底物濃度和水解度的上升而下降。其原因可能是水解度的增大，底物中的蛋白易被水解的肽鍵數(shù)量減少和酶活降低，從而導致水解反應速率下降，這與圖1和圖2中的試驗結(jié)果相符。由圖3可知，a值與E0/S0值有良好的線性關(guān)系，與反應機理推導所得的公式一致，再次證明動力學模型的有效性[29]。酶解反應速率常數(shù)k2=39.522 min-1。

2.4 蛋白酶失活常數(shù)的確定

將方程（9）、（10）、（12）代入方程（5），可得：

式中：k4為水解反應過程中堿性蛋白酶的失活常數(shù)。

將a與b相乘得到關(guān)系式：

圖4 ab值隨著不同的E0/S0值的變化趨勢Fig.4 Change trend of ab value with different E0/S0 values

由y=6.371x+0.005 2，R2=0.972 4，可知a值隨著E0/S0值關(guān)系曲線所對應的方程（28）：

可知鷹嘴豆蛋白水解過程中堿性蛋白酶的失活常數(shù)為k4=6.371 min-1。

2.5 鷹嘴豆蛋白酶解動力學模型驗證

為了驗證上述動力學模型的準確性，將動力學模型的結(jié)果與實際水解結(jié)果進行對比。確定初始酶解條件為底物濃度3%，酶濃度4 000 U/g，pH8.0，溫度55℃，結(jié)果如圖5所示。

圖5 實際水解度與模型預測水解度Fig.5 Hydrolysis degree of actual and predicted model

如圖5所示，在水解初始階段，試驗值略低于擬合值，可能由于不同肽鏈長度的酶解產(chǎn)物對水解反應速率的抑制作用，同時底物中的蛋白質(zhì)肽鏈解聚與肽鏈斷裂使肽鏈解聚不充分，導致酶與底物結(jié)合不充分，所以擬合值比試驗值略高[30]。從整體來看，動力學模型的預測值與試驗值吻合較好，表明所建動力學模型對實際酶解過程具有一定的指導作用。

3 結(jié)論

（1）基于米氏方程理論，應用數(shù)學推導結(jié)合試驗研究的方法得到鷹嘴豆蛋白酶解動力學模型。

（2）通過試驗發(fā)現(xiàn)：鷹嘴豆蛋白水解過程中酶解速率隨水解時間升高而降低；在一定濃度范圍內(nèi)，鷹嘴豆蛋白的水解度隨堿性蛋白酶質(zhì)量濃度的升高而增大，隨初始鷹嘴豆蛋白質(zhì)量濃度的升高而降低，在水解過程中同時存在產(chǎn)物和底物抑制現(xiàn)象。

（3）鷹嘴豆蛋白水解速率的動力學模型：R=（39.522E0-0.080 4S0）exp[-0.148（DH）]，水解度-水解時間的動力學模39.522E0/S0-0.080 4，b=0148。根據(jù)酶反應動力學的基本理論及相關(guān)試驗結(jié)果，得出堿性蛋白酶水解過程酶失活的動力學常數(shù)Kd=6.371 min-1。通過動力學模型的驗證試驗，得出試驗結(jié)果與模型擬合度很好，說明所建鷹嘴豆蛋白酶解動力學模型可用于指導和優(yōu)化酶解工藝。