固相萃取-反相高效液相色譜測定食品中大豆異黃酮含量的方法研究

馬翛然，張洛莎，王 鵬，鄭晨曦，高麗華，劉 婷*

（1.北京食品科學研究院，北京 100068；2.北京工業大學 生命科學與生物工程學院，北京 100124）

中國的傳統大豆食品一般可分為非發酵的和發酵的兩大類。非發酵的有整豆（如毛豆、青豆、干豆、黑豆等）、豆芽、豆漿、豆腐、干豆腐和油豆腐等；發酵的有醬油、豆豉、豆醬、腐乳和酸豆奶等，均各成一類，擁有很多花色品種。鑒于大豆顯著的營養價值和功能性質，大豆食品被有關營養與食品專家認定為21世紀全球最受歡迎的健康食品之一[1]。

大豆不僅含有優質蛋白質和植物油，還含有對人體健康有益并具有各種生理功能的一類天然活性物質—大豆異黃酮[2]，其化學結構見圖1。大豆異黃酮是黃酮類化合物，是大豆生長中形成的一類次級代謝產物，與雌激素有相似的分子結構，同時也是一種植物多酚。其分子基本結構為2-苯基色原酮，泛指兩個苯環通過三碳鏈相互連結而形成一系列化合物。其名稱及取代基見表1。大豆異黃酮具有雌激素活性[2-4]、降低膽固醇[2-4]、預防心血管疾病[2-4]、抑制腫瘤生長[2-4]、抗氧化性[5]、預防和治療骨質疏松[6-7]和緩解婦女更年期綜合癥[8-9]等特定的生理作用以及保健功能[10-15]，受到人們廣泛的關注及重視。

圖1 8種異黃酮的化學結構Fig.1 Chemical structure of 8 isoflavones

表1 8種異黃酮的名稱及取代基Table 1 Names and substituent groups of 8 isoflavones

目前，我國大豆制品生產仍存在生產集中度較低、小作坊多、技術水平低、設備陳舊簡陋、產品功能性差、資源利用率低和生產管理難以標準化等諸多影響產品質量的瓶頸問題，而且我國現行的大豆異黃酮含量測定的國家標準[16-17]適用范圍小，專屬性不強，已不適合當前市場上品種繁多的大豆食品中異黃酮的含量分析。因此，迫切需要建立新的大豆異黃酮分析方法以完善現行的國家標準，為有效控制產品的質量提供理論依據。這不僅對企業生產中的質量控制有利，也有利于大豆食品的市場監管，在國家大豆食品安全體系的建設中占有重要的地位。

高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）是目前應用最廣泛的一種檢測方法，相較其他分析方法，具有準確度高、靈敏度高、選擇性和重現性好的優點。文獻報道[7-13，16-25]的HPLC法測定大豆異黃酮的含量所使用的提取方法、色譜分離方法以及儀器條件等均有不同，所涉及的樣品種類不同，主要有大豆[10-12，21，27-29，31]、黑豆[29]和紅豆[29]、醬油[13]、豆豉[14]、腐乳[15]、葛根[18]和三葉草[19]、膳食補充劑[20]、豆醬[21]、生物樣品人體尿液[22-23]和血清[24]、豆漿[25]等，這導致異黃酮提取效率、檢測結果和方法的適用范圍各異。本研究以測定大豆食品中異黃酮含量為主要內容，在國家標準的基礎上嘗試優化黃豆黃素、黃豆黃苷、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、鳶尾黃酮苷、鷹嘴豆芽素A共8種異黃酮的提取方法，擬建立了一種適用范圍廣，而且能同時測定8種異黃酮成分的高效液相色譜法，對控質大豆食品的質量提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（色譜純）：Fisher Chemical公司；黃豆素（純度＞99.44%）、黃豆苷（純度＞99.23%）、大豆苷（純度＞98%）、大豆苷元（純度＞99.9%）、染料木素（純度＞98%）、染料木苷（純度＞98.7%）、鳶尾黃酮苷（純度＞98.86%）、鷹嘴豆芽素A（純度＞99.65%）：上海安譜科學儀器有限公司；高純水（電阻率＞18 MΩ）：美國密博里公司；其余試劑均為分析純：國藥集團化學有限公司。

試驗樣品為大豆及大豆制品如豆漿、豆奶等共23種，均為市售產品。樣品的名稱和配料見表2。

表2 23種樣品的名稱和配料Table 2 Names and ingredients of 23 samples

續表

1.2 儀器與設備

1260型高效液相色譜儀（HPLC），配置二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）：美國安捷倫公司；固相萃取柱（Waters Sep-pakRVac 12cc（2g）C18Cartridges）：美國Supelcol公司；pHS-3C型酸度計：上海儀電科學儀器股份有限公司；KQ-100DB型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；H-1650型離心機：上海博翎儀器設備有限公司；RE-2000A旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液配制

（1）標準溶液儲備液的配制：準確稱取標準品黃豆黃苷、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、鷹嘴豆芽素A各10.0 mg于10 mL容量瓶中，用體積分數90%甲醇-水溶液溶解后定容至刻度，作為標準儲備液；黃豆黃素和鳶尾黃酮苷在甲醇和水中的溶解性較差，分別稱取10.0 mg于100 mL和50 mL容量瓶中，用體積分數為90%甲醇溶液溶解后定容至刻度，作為標準儲備液。

（2）標準溶液使用液的配制：分別移取適量體積的黃豆黃素、黃豆黃苷、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、鳶尾黃酮苷、鷹嘴豆芽素A標準儲備液于10mL容量瓶中，用甲醇定容至10.0mL，配制成質量濃度分別為1.00μg/mL、2.00μg/mL、5.00μg/mL、10.00μg/mL、20.00μg/mL、30.00μg/mL、40.00μg/mL、50.00μg/mL的標準系列工作溶液。

1.3.2 大豆異黃酮提取

（1）液體樣品：準確稱取1 g待測樣品，用體積分數為90%甲醇溶液溶解定容至5 mL，搖勻后待凈化處理。

（2）固體和半固體樣品：樣品粉碎過篩后，準確稱取1 g樣品于50 mL離心管中，加入25mL體積分數為90%甲醇溶液，超聲提取30 min，經3 000 r/min離心15 min后，吸取上清液至150 mL旋蒸瓶。再向樣品中加入25 mL體積分數為90%甲醇溶液，超聲提取30 min，3 000 r/min離心15 min后，吸取上清液至旋蒸瓶。將收集的上清液經旋轉蒸發儀濃縮至近干，用體積分數為90%甲醇定容至5 mL刻度管中，搖勻后待凈化處理。

1.3.3 提取液的凈化

提取液用C18固相萃取柱凈化。在凈化前，先加入10mL甲醇，再加入20 mL水活化柱子；再將上述經預處理后的樣品提取液轉移入柱并使組分保留在柱上；用15 mL水淋洗，最大程度除去干擾物；最后，用5 mL 0.5%甲酸甲醇溶液將待測物質洗脫下來并收集。收集液經0.22μm有機相濾膜過濾，待高效液相色譜測定。

1.3.4 樣品加標試驗

稱取樣品后加入適量的標準溶液，其他步驟同1.3.2。

1.3.5 色譜測定條件

色譜柱：Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：A：pH 3.10磷酸水溶液，B：乙腈；流速：1.0 mL/min；柱溫：40℃；檢測波長：254 nm；進樣量：20μL。梯度洗脫程序如表3所示。

表3 流動相梯度洗脫程序Table 3 Gradient elution procedures of mobile phase

2 結果與分析

2.1 檢測條件的選擇

2.1.1 檢測波長的確定

8種大豆異黃酮在波長190～400 nm范圍內的紫外光譜圖見圖2。

圖2 8種大豆異黃酮的紫外吸收光譜圖Fig.2 UV absorbance spectrum of 8 soybean isoflavones

從圖2看出，8種大豆異黃酮在波長240～260nm處均有最大吸收。結合參考文獻，比較了波長245nm[22]、254nm[18，22-24]、260 nm[5，19-21]等幾個不同波長的色譜響應，結果表明，在波長254 nm處測定靈敏度高，且各組分峰的響應值均較高，因此采用254 nm作為檢測波長。

2.1.2 色譜柱的選擇

根據文獻[15-32]，對大豆異黃酮的分離分析均為采用C18柱的反相高效液相色譜。比較了8種異黃酮在Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18、ZORBAX Stable Bond C18和C8三種型號的色譜柱上的分離效果，結果證明，在相同的色譜條件下SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）對異黃酮的分離效果最好，因此選擇SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱作為分析柱。

2.1.3 流動相的選擇

考察了不同流動相、pH和流動相配比對異黃酮色譜行為的影響。以含0.1%的乙酸水溶液和0.1%的乙酸乙腈溶液作流動相，在采取梯度洗脫的方式時，大豆苷和黃豆黃苷、染料木苷和鳶尾黃酮苷均沒有完全分離開；采用0.5%的甲酸水溶液和甲醇作為流動相，染料木苷和鳶尾黃酮苷沒有完全分離開，染料木素與黃豆黃苷色譜峰重合；采用0.05%三氟乙酸水溶液和乙腈作為流動相，8種異黃酮仍然無法完全達到基線分離，且鷹嘴豆芽素A的出峰時間較長；以pH 2.96～3.98的H3PO4水溶液和甲醇為流動相，通過優化兩相的配比，8種異黃酮均可獲得滿意的分離度，而且流動相中H3PO4水溶液pH值在2.96～3.18時，異黃酮的分離效果沒有明顯差異。綜合考察各種影響因素后，采用pH 3.10的H3PO4和甲醇為流動相。

2.1.4 試樣提取方法的選擇

依據文獻[16-24]報道并結合分析檢測的實際情況，采用甲醇和水混合液作為異黃酮的提取溶劑。比較了甲醇和水體積比為60∶40、70∶30、80∶20、90∶10和100∶0時的提取效果，考察色譜峰峰面積與取樣量的比值，提取效果以90∶10的甲醇和水溶液為最佳，最終選擇體積比為90∶10的甲醇和水作為提取液。

考察了超聲提取時間對提取效率的影響，平行稱取同一樣品3份，分別超聲處理20min、30min、40min，計算峰面積與取樣量的比值，結果表明，超聲提取時間為30min和40min時提取效果無顯著差異，而超聲提取時間為20 min的提取效果較差。根據實驗結果，選擇超聲處理時間為30 min。

考察了固相萃取洗脫溶液對凈化效果的影響，結果選擇0.5%甲酸甲醇溶液作為洗脫溶液。

2.2 標準曲線的線性范圍

分別將不同濃度的大豆異黃酮混合標準溶液按色譜條件進行測定，得到8種大豆異黃酮標準溶液色譜圖，見圖3。

圖3 8種大豆異黃酮混合標準溶液高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of 8 soybean isoflavones mixed standard solution

表4 8種大豆異黃酮標準曲線的回歸方程和線性范圍Table 4 Regression equation and linear range of standard curves of 8 soybean isoflavones

以異黃酮質量濃度（ρ，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標作圖，8種異黃酮的標準曲線回歸方程、線性范圍和相關系數見表4。

由表4可知，8種異黃酮在質量濃度為1.00～50.00μg/mL范圍內線性關系良好，相關系數R2均＞0.999。

2.3 精密度試驗

以質量濃度為20μg/mL的8種異黃酮混合標準溶液連續重復進樣8次進行精密度試驗，分別測定8種異黃酮的含量并計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果見表5。

由表5可知，8種異黃酮標準品的測定結果RSD在1.03%～4.33%的范圍內，表明該方法精密度良好。

表5 方法精密度實驗結果Table 5 Results of precision tests of the method

2.4 加標回收率試驗

在上述優化后的試驗條件下，分別對樣品添加20μg/g、40μg/g和200μg/g的標準品后進行測定，加標回收率試驗結果見表6。

表6 加標回收率試驗結果Table 6 Results of adding standard recovery tests

續表

由表6可知，大豆苷的回收率為79.3%～87.6%，黃豆黃苷的回收率為82.8%～86.5%，染料木苷的回收率為81.8%～88.2%，鳶尾黃酮甙的回收率為85.3%～95.1%，大豆苷元的回收率為95.6%～100.6%，黃豆黃素的回收率為94.3%～106.2%，染料木素的回收率為92.5%～104.4%，鷹嘴豆芽素A的回收率為95.6%～102.0%。測定結果表明，方法的準確性良好，8種化合物的回收率結果相對標準偏差（RSD）均≤3.1%，測定方法可以滿足分析要求。

2.5 方法的檢出限和定量限

根據國家標準GB/T 27417—2017《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》對檢出限和定量限的規定，以3∶1的信噪比確定方法的檢出限，以10倍的信噪比確定方法的定量限。黃豆黃素、黃豆黃苷、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、鳶尾黃酮苷、鷹嘴豆芽素A的檢出限為0.2mg/kg，定量限為5 mg/kg。

2.6 樣品中大豆異黃酮的含量

經測定，23種樣品中所含的大豆異黃酮的具體含量見表7。

表7 樣品中大豆異黃酮含量的測定結果Table 7 Determination results of soybean isoflavones contents in the samples mg/kg

由表7可知，腐竹中的大豆異黃酮種類豐富，并且含量較多，其中染料木苷的含量最多，為909.15mg/kg。而黃豆醬油所含大豆異黃酮最少，僅含有黃豆黃素、黃豆黃苷和大豆苷元，其中黃豆黃素的含量最多為2.55mg/kg。黑豆和黃豆中的異黃酮總量較高，分別為1354.10mg/kg和1054.51mg/kg，而郫縣豆瓣醬中未檢出大豆異黃酮。由此可見，腐竹是大豆異黃酮較為豐富的食品，大多數大豆異黃酮在加工時未被破壞，而黃豆醬油中的大豆異黃酮含量較少的原因有可能是在發酵過程中，部分大豆異黃酮降解或損失，這與周熒[15]對腐乳發酵過程中大豆異黃酮組分的變化及理化性質的研究結論是一致的，證明在發酵過程中大豆異黃酮的總含量逐漸減少。值得注意的是，大豆異黃酮的含量不僅與加工工藝有關，也取決于大豆食品加工中使用的大豆原料。此外，大豆中的主要黃酮類物質是黃豆黃素、黃豆黃苷、大豆苷、大豆苷元、染料木素和染料木苷，因此在所有樣品中都沒有檢出鳶尾黃酮苷和鷹嘴豆芽素A。

3 結論

由于大豆制品的營養健康功效不斷被人們所認識，我國大豆食品的生產和消費出現了空前的繁榮。我國地域廣闊，生產的傳統食用豆制品口味、品種更趨于多元化。因此，完善和提升現行國標，建立適用范圍廣泛的大豆異黃酮的分析方法對于大豆食品的質量控制和市場監管是極其重要的。本研究建立了一種測定多種大豆、大豆制品等食品中黃豆黃素、黃豆黃苷、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、鳶尾黃酮苷、鷹嘴豆芽素A共8種異黃酮含量的固相萃取-HPLC紫外光譜檢測法。該法采用甲醇水溶液提取異黃酮，提取液用C18固相萃取柱凈化，采用C18色譜柱分離，柱溫40℃，以乙腈-磷酸水溶液為流動相，流速1.0 mL/min，紫外檢測器254 nm進行檢測，8種黃酮類化合物的標準曲線線性范圍為1.00～50.00μg/mL，其精密度實驗結果的相對標準偏差均＜5%，回收率在79.3%～102.5%范圍內，檢出限為0.2 mg/kg，定量限為5 mg/kg。實驗結果表明，本方法適用范圍廣、分離度好、準確性好、靈敏度高，可以作為有效控制大豆食品質量的依據，具有一定的理論意義和應用價值。