柱前衍生-高效液相色譜法檢測運動型飲料中γ-氨基丁酸的含量

吳 慧，崔本來

（1.商丘學院 風景園林學院，河南 商丘 476113；2.商丘學院 體育學院，河南 商丘 476113）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種多功能分子，對人體有多種生理功能，如增進腦活力、營養神經細胞、增加生長激素分泌、健肝利腎等[1-3]，而運動型飲料中也會添加此種物質來增加其產品的功效和賣點。運動型飲料是一種根據人體運動生理特點而配制的飲品，能補充人體運動后或者疲勞時所需的營養物質[4-5]，因其是針對特殊人群飲用的一種飲品，具有一定的特殊性，對食品的安全性要求高，所以更需要對這類產品中GABA的添加情況進行檢測和監控。

目前γ-氨基丁酸的檢測方法主要有薄層色譜（thin-layer chromatography，TLC）法、毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）法、氨基酸分析儀法和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法等[6-10]。其中紙層析法的精準度較低，毛細管電泳法實驗操作的過程較復雜，氨基酸自動分析法的分析儀器價格較昂貴，而高效液相色譜法因準確、高效而被廣泛應用。因GABA本身對紫外光吸收小，一般需要衍生化后才能使用紫外檢測器檢測[11]。目前常用的衍生試劑有苯二醛-2-巰基乙醇、丹磺酰氯以及鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）等[12-15]，其中OPA具有價格便宜、衍生時間短、簡單易操作等優點，作為一般實驗選用的衍生試劑。但OPA的衍生產物不穩定、衍生后需快速進樣[16]，故本研究采用在線柱前自動化衍生裝置，對測定GABA的色譜條件、衍生條件及運動飲品的前處理條件進行優化，旨在建立一套系統性的在線柱前衍生-高效液相色譜分析運動型飲料中γ-氨基丁酸含量的方法，為運動型飲料中γ-氨基丁酸的分析和監控提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

運動型飲料：隨機購買于超市中，標稱為運動型飲料的樣品。

1.1.2 試劑

γ-氨基丁酸標準品（純度99.9%）：國家標準物質中心；鄰苯二甲醛、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

2695型高效液相色譜、2998型二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）、Waterssunfire C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）：美國Waters公司；Thermo hypersil gold C18柱（4.6mm×250 mm，5μm）：美國Thermo公司；Agilent Zorbax SBAQ柱（4.6mm×250mm，5μm）：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件的優化

采用高效液相色譜儀串聯二極管陣列檢測器對GABA進行檢測，分別對色譜柱種類（Waterssunfire C18柱、Thermo hypersil gold C18柱、Agilent Zorbax SBAQ柱）[17-18]、流動相種類（20mmol/L磷酸緩沖溶液-甲醇、20mmol/L乙酸鈉-乙腈）[19-20]以及檢測波長（190～450 nm）3個色譜條件進行優化。其中流動相梯度洗脫程序Ⅰ：A（20mmol/L磷酸緩沖溶液）-B（甲醇）為B 30%、0～5.0 min，B 30%～50%、5.0～12.0 min，B 50%～30%、12.0～15.0 min；流動相梯度洗脫程序Ⅱ：A（20mmol/L乙酸鈉）-B（乙腈）為B 30%、0～5.0min，B 30%～50%、5.0～12.0min，B 50%～30%、12.0～15.0min；流動相等度洗脫程序Ⅲ：A（20mmol/L乙酸鈉）-B（乙腈）為70∶30（V/V）。

其余色譜條件為流速：1.0 mL/min；進樣量：20μL；柱溫：30℃。

1.3.2 柱前衍生條件的優化

衍生試劑的制備：稱取0.1 g OPA，用1 mL乙腈溶解，加100μL巰基乙醇，用0.5mol/L的硼酸緩沖液定容至10mL，過0.22μm濾膜，4℃可保存1周。

OPA柱前衍生化具有高度靈敏性，但衍生產物不穩定，因此，本試驗選取不同衍生時間（0.5 min、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min）和不同衍生溫度（40 ℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃），采用在線柱前衍生裝置對50μg/mL的GABA標準品進行衍生，初始衍生溫度為40℃，考察衍生時間及溫度對目標物組分峰面積的影響。

具體步驟：準確稱取5.0mL樣品，加入乙腈溶液5mL超聲提取10min，然后將提取液在3000r/min條件下離心10min，吸取上清液待用。取標準品液或者樣品上清液與衍生試劑在線混勻，分別分析衍生反應時間以及衍生反應溫度對GABA峰面積的影響。

1.3.3 GABA標準曲線的繪制

分別稱取一定質量的GABA標準品，配制成質量濃度為1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL的標準溶液，采用在線柱前衍生裝置與衍生試劑OPA衍生后分析，以GABA質量濃度（x）為橫坐標，GABA峰面積（y）為縱坐標繪制GABA標準曲線。

1.3.4 萃取溶劑的選擇優化

運動型飲料中γ-氨基丁酸的提取，一般選用萃取溶劑進行萃取。本實驗分別比較了4種不同的萃取溶劑（乙醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯）對GABA的萃取率的影響[21-23]。以已知GABA含量的運動型飲料為基質，加入50μg/mL的GABA標準品，比較萃取率，萃取步驟見1.3.2，選擇較優的萃取劑進行樣品的前處理。萃取率計算公式如下：

式中：y為萃取率，%；x為萃取后樣品中的目標物的含量，μg/mL；xo為原樣品中目標物的含量，μg/mL；a為樣品中加入的目標物的含量，μg/mL。

1.3.5 回收率與精密度的測定

以已知GABA含量的運動型飲料為基質，加入不同質量濃度（5.0 mg/L、10.0 mg/L、50.0 mg/L）的GABA標準液，選擇優化后的前處理條件操作，上機檢測，計算回收率及相對標準偏差（relativestandard deviation，RSD），每個質量濃度重復測定5次。回收率計算公式如下：

式中：Y為回收率，%；X為加標后樣品中的GABA的含量，mg/L；XO為已知運動飲料中GABA的含量，mg/L；A為樣品中加入的GABA的含量，mg/L。

1.3.6 樣品的檢測

在市場上隨機抽取5種運動型飲料，采用最優的檢測條件測定樣品中GABA的含量。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 色譜柱的選擇

不同色譜柱對GABA檢測的影響結果見圖1。

圖1 3種色譜柱條件下GABA的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms ofγ-aminobutyric acid using 3 kinds of chromatographic columns

由圖1可知，GABA在Waterssunfire C18柱中基線穩定，峰形較對稱，在其他兩種色譜柱中基線漂移、峰形響應值不高，所以采用Waterssunfire C18柱對GABA進行色譜分析。

2.1.2 流動相的確定

GABA的柱前衍生物分離一般采用磷酸緩沖溶液-甲醇或者乙酸鈉-乙腈為流動相，不同流動相對GABA標準品檢測的影響結果見圖2。

圖2 GABA標準品的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms ofγ-aminobutyric acid standard

由圖2可知，磷酸緩沖溶液-甲醇或者乙酸鈉-乙腈為流動相，梯度洗脫時，洗脫的時間較長且基線不穩。而以20 mmol/L的乙酸鈉溶液-乙腈（體積比70∶30）為流動相等度洗脫時，GABA標準品的HPLC色譜圖基線穩定且響應值最大，12 min內GABA能達到有效地分離。因此，最適流動相為20 mmol/L的乙酸鈉溶液-乙腈（體積比70∶30）等度洗脫。

2.1.3 檢測波長的選擇

為了提高方法的靈敏度，選擇合適的檢測波長，采用二極管陣列檢測器在檢測波長190～450 nm范圍內對GABA標準品進行全波長掃描。DAD的檢測波長對GABA標準品檢測效果的影響見圖3。

圖3 GABA的全波長掃描圖Fig.3 Full wavelength scan ofγ-aminobutyric acid

由圖3可知，γ-氨基丁酸衍生物的特征吸收波長有3處，其中216 nm處為最大吸收波長，但此波長處干擾峰較多。為了確保目標組分既要有最大的吸收值，又要避免基質的噪音干擾。綜合考慮，選取波長247nm為GABA的檢測波長。

2.2 柱前衍生條件的優化

2.2.1 衍生時間的影響

柱前衍生時間對GABA標準品峰面積的影響結果見圖4。

圖4 衍生時間對GABA峰面積的影響Fig.4 Effect of derivatization time on the peak area of γ-aminobutyric acid

由圖4可知，衍生反應時間在2 min左右時，GABA標準品的峰面積達到42，再延長衍生時間，GABA的穩定性變差，峰面積變小，由于GABA的峰面積與其測定含量為正相關，所以選擇2 min作為衍生反應的時間。

2.2.2 衍生溫度的影響

設定OPA柱前衍生化反應的時間為2min，衍生溫度對GABA標準品峰面積的影響結果見圖5。

圖5 衍生溫度對GABA峰面積的影響Fig.5 Effect of derivatization temperature on the peak area of γ-aminobutyric acid

由圖5可知，隨著衍生溫度的升高，GABA的峰面積呈現先增大后減少的趨勢，由400增大到525。當衍生溫度在45℃左右時，衍生物的峰面積趨于穩定，峰面積在500左右，相差不大；當衍生溫度＞60℃之后，衍生物不穩定，GABA峰面積急劇下降至350，所以選擇45℃作為衍生溫度。

2.3 GABA標準曲線的繪制

以GABA含量（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標繪制GABA標準曲線見圖6。

由圖6可知，GABA質量濃度在1.0～100.0μg/mL范圍內具有良好的線性關系，R2為0.998 6，其檢出限為0.30 mg/kg，定量限為1.0 mg/kg。

圖6 γ-氨基丁酸的標準曲線Fig.6 Standard curve ofγ-aminobutyric acid

2.4 萃取溶劑優化

不同萃取溶劑對運動型飲品中GABA萃取率的影響結果見圖7。

圖7 萃取溶劑對GABA萃取率的影響Fig.7 Effect of extraction solvent on the extraction rate of γ-aminobutyric acid

由圖7可知，由于運動型飲品中營養元素較多，丙酮作為萃取劑，混合、離心后樣品溶液渾濁，乙酸乙酯為萃取劑對GABA的萃取率僅有37%，只有乙醇和乙腈萃取GABA較完全，萃取率能達到74.5%和86.7%，但是乙醇與飲品分層不明顯。因此，選擇乙腈為萃取溶劑。

2.5 加標回收率與精密度

以未添加γ-氨基丁酸的運動型飲料為基質，分別添加不同質量濃度的標準溶液后進行加標回收率試驗，測定結果見表1。

表1 方法的加標回收率及相對標準偏差的測定結果（n=5）Table 1 Determination results of the adding standard recovery rate and RSD of the method(n=5)

由表1可見，加標回收率為82.5%～90.6%，相對標準偏差（RSD）為2.9%～3.7%，表明本實驗所建立的方法能夠滿足檢測實際樣品需要。

2.6 運動型飲料樣品的測定

5種運動型飲料中GABA的檢測結果見表2。

表2 5種運動型飲料樣品中GABA含量的測定Table 2 Determination of GABA content in 5 kinds of sports drinks samples

由表2可知，5種運動型飲品中都添加了GABA，含量范圍為0.32～16.38 mg/100 mL，整體與產品外包裝標簽中標出的一致，但是不同品牌之間GABA的含量具有明顯差異（P＜0.05）。消費者在目標性地選用含有此物質的運動飲料時，還是應進行比較，這樣會達到更有效的補充目的。

3 結論

本實驗通過優化HPLC條件、在線柱前衍生條件及萃取條件建立了一種在線柱前衍生-高效液相色譜法檢測運動型飲料中γ-氨基丁酸的分析方法。結果表明，色譜條件：Waters sunfire C18色譜柱，20 mmol/L的乙酸鈉溶液-乙腈（體積比70∶30）作為流動相，二極管陣列檢測器的檢測波長247 nm，柱溫30℃，流速1.0 mL/min，進樣量20μL；在線柱前衍生條件：OPA為衍生劑，柱前衍生時間2.0 min，衍生溫度45℃。在最優檢測條件下，GABA在1.0～100.0μg/mL質量濃度范圍內均具有良好的線性關系（R2=0.9986），檢出限為0.30 mg/kg，定量限為1.0 mg/kg。萃取條件為乙腈為萃取溶劑，體積比1∶1，超聲提取10 min。該方法的加標回收率為82.5%～90.6%，RSD為2.9%～3.7%，所建立的方法具有可靠的準確度和精密度，能準確快速有效地檢測運動型飲料中GABA的含量，可為運動型飲料中γ-氨基丁酸的分析和監控提供技術支持。