應用離子色譜法檢測牛欄山二鍋頭原酒中有機酸類物質

王 勇，魏金旺*

（北京順鑫農業股份有限公司 牛欄山酒廠，北京 101301）

牛欄山酒廠地處北京市順義區牛欄山鎮，在釀造二鍋頭的工藝過程中，一直保持著制曲、立茬、發酵等一系列工序。牛欄山二鍋頭以高粱為釀酒原料，采用清香型低溫大曲或麩曲為糖化發酵劑，低溫入缸（池）的清蒸清茬地缸發酵，清蒸二次清和瓷磚池發酵，混蒸續茬老五甑工藝，發酵期為21～30d[1-4]。在質量上保持了傳統的清香純正、口味甘洌、酒體醇厚、酒力強勁的特點[5-6]，牛欄山二鍋頭酒作為我國清香型的典型代表性白酒之一，在國內外也具有較高的知名度，逐漸成為北京的一種城市名片[7-9]。牛欄山二鍋頭獨特的風味特征由上百種風味物質共同作用形成，王勇等[10-11]采用浸入式固相微萃取、液液萃取結合氣相色譜-質譜（gas chromatography-massspectrometer，GC-MS）聯用技術對牛欄山二鍋頭的風味物質進行了定性研究，并采用保留指數法對定性結果進行了驗證，共獲得了101種香氣化合物的確切定性結果，其中包括35種酯類、13種酸類、15種醇類、5種醛類、1種酮類、15種芳香族及酚類、5種呋喃類、2種吡嗪類、3種縮醛類、1種硫化物、6種其他類化合物；采用氣相色譜-聞香-質譜（gaschromatography-olfactorymass spectrometry，GC-O-MS）聯用儀方法解析了牛欄山二鍋頭中重要的香氣組分特征，采用液液萃取法提取牛欄山二鍋頭白酒中的香氣化合物，進行聞香分析GC-O和GC-MS分離鑒定，一次性檢出92種香氣化合物，其中對牛欄山二鍋頭白酒整體香氣貢獻大的香氣成分有25種。但目前關于牛欄山二鍋頭中不揮發性風味物質的研究還很少有報道，“無酸不成味”，有機酸類物質是白酒的重要風味物質，白酒中有機酸的種類和含量對白酒的風味特征具有重要的影響，對白酒中有機酸種類、含量和生成規律的分析研究對于評價酒體質量、優化釀造工藝具有重要意義。

目前，飲料酒中有機酸的分析方法主要有分光光度法、反向高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法、氣相色譜質譜（GC-MS）聯用法、離子色譜（ion chromatography，IC）法等。其中離子色譜法因其靈敏度高、重復性好、操作簡單成為飲料酒中有機酸分析廣泛采用的方法。近年來，該方法開始應用于白酒中有機酸的分析檢測。劉瓊[12]選用濃香型白酒為樣品，進行分析方法應用的探討，并與氣相色譜分析方法作對比。離子色譜法分析白酒樣品中6～8個有機酸組分，只需約15 min，方法回收率98%～100%，重復實驗的變異系數在5%以下。卜宇宏[13]運用離子交換分析方式加上抑制型電導檢測，作出白酒中有機酸的特征圖譜，結果表明乳酸、乙酸、丁酸、己酸的線性范圍分別為15～35 mg/L、25～45 mg/L、5～25 mg/L、30～50 mg/L，4種有機酸樣品加標回收率為98%～103%，說明該分析方法具有靈敏度高、分析速度快的特點。潘丙珍等[14]建立用離子色譜/電導檢測法測定酒類中有機酸和無機陰離子的分析方法，對11種有機酸和5種無機陰離子具有良好的線性，相關系數在0.990 9～0.9997；準確度和精密度良好，樣品加標回收率在81.0%～117.8%，相對標準偏差（relativestandaral deviation，RSD）＜5.0%；檢出限低，在0.015～0.152mg/L。但是目前該方法還未見應用于清香型白酒原酒中有機酸類風味物質的分析檢測。

本研究建立離子色譜法對清香型原酒中的有機酸進行檢測，并著重分析研究了牛欄山二鍋頭原酒中的有機酸類物質，探明有機酸在不同原酒中的分布規律，對研究濃香型、醬香型等原酒中的有機酸提供理論研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

牛欄山二鍋頭原酒：北京順鑫農業股份有限公司牛欄山酒廠。分別選取大茬和二茬酒頭、前段、中段、后段、尾段5個不同摘酒段，共十個酒樣。

1.1.2 化學試劑

有機酸標準樣品（甲酸鈉、乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉、丙酮酸鈉、乳酸鈉、琥珀酸鈉、草酸鈉、富馬酸鈉、檸檬酸鈉、異丁酸、異戊酸、2-乙基丁酸、戊酸、己酸、山梨酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、烏頭酸）：美國Sigma公司，母液均配制為1 000 mg/L，儲存于2～8℃。所用溶液均用電阻率為18.2 MΩ·cm超純水配制。

1.2 儀器與設備

ICS-3000型離子色譜儀（配有EG40淋洗液自動發生器、電導檢測器和Chromeleon 6.80色譜工作站）、Ionpac AS11-HC型分離柱（250 mm×4 mm）、Ionpac AG11-HC型保護柱（50 mm×4 mm）、ASRS-ULTRA陰離子抑制器：美國Dionex公司；0.45μm過濾膜、Milli-QIQ 7000超純水系統：美國Millipore公司；HGC-12A氮吹儀：重慶中譜科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 離子色譜條件

色譜柱：Ionpac AS11-HC型分離柱（250 mm×4 mm），Ionpac AG11-HC型保護柱（50 mm×4 mm）；柱溫：30℃；流動相：EG自動產生淋洗液梯度淋洗，KOH梯度淋洗程序見表1；流速：1.0 mL/min；抑制器再生模式：外加水電抑制；電導檢測器檢測；進樣量：25μL。首先選擇單一有機酸進行檢測，尋找其出峰時間及峰面積；其次選擇混合標樣進行檢測。按照出峰時間進行有機酸的定性，使用離子色譜自主選擇峰面積進行有機酸的定量。

表1 白酒有機酸分析KOH梯度淋洗程序Table 1 KOH gradient eluting procedure of organic acid in Baijiu analysis

1.3.2 樣品前處理

將牛欄山二鍋頭酒樣稀釋50倍，過0.45μm過濾膜后直接進樣，可直接定量濃度較高且保留時間靠前的部分有機酸（如乳酸、乙酸等）；將8 mL的酒樣在30℃條件下氮吹至1 mL，用超純水定容至2 mL，過0.45μm過濾膜后進樣檢測，即濃縮4倍進樣檢測，可以定量濃度較低且保留時間靠后的有機酸（如二元酸等）。

按照上述樣品處理方式進行離子色譜檢測，按照標準曲線回歸方程計算樣品中有機酸含量，回收率是通過離子色譜檢測值與已知標樣濃度的比值。

2 結果與分析

2.1 清香型白酒原酒中有機酸的檢測方法的建立

根據離子色譜的檢測，有機酸標準曲線回歸方程、線性范圍、檢出限及回收率結果見表2，有機酸標準品離子色譜圖見圖1。

由表2可知，各有機酸測得的線性相關系數R2均在0.99以上，加標回收率除甲酸外（74.90%），在82%～118%之間。該方法具有操作簡單、靈敏度高、檢測有機酸種類多的特點，適合于清香型原酒中有機酸的分析檢測。

由圖1可知，該方法可在50 min內實現21種有機酸類的完全分離，并且在保證各種有機酸都能出峰的基礎上，每個峰面都不重合，出峰時間能夠完全分離開。因此，該檢測方法能有效地檢測清香型原酒中的有機酸，并且檢測有機酸種類較多。

表2 21種有機酸離子色譜分析標準曲線回歸方程、線性范圍、檢出限和回收率Table 2 Standard curves regression equation,linear range,detection limits and recovery rates of 21 organic acids analyzed by ion chromatography

圖1 21種有機酸混合標準溶液離子色譜圖Fig.1 Ion chromatography of 21 mixed standard solutions of organic acids

2.2 牛欄山二鍋頭原酒中有機酸種類及含量分析

采用1.3.2的處理原酒方法，對牛欄山二鍋頭原酒中有機酸種類和含量進行分析，結果見表3。由表3可知，在牛欄山原酒中共檢出9種有機酸，主要包括乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、異丁酸、正丁酸、異戊酸、己酸、丙酮酸。對不同原酒中有機酸定量分析發現，乙酸、乳酸是牛欄山原酒中的主要有機酸類物質，其中乙酸質量濃度范圍為233.86～2416.98mg/L，占有機酸總含量的41.1%～79.3%；乳酸質量濃度范圍為18.34～6504.96mg/L，占有機酸總含量的14.5%～57.5%；其他有機酸濃度較低，占有機酸總含量的1.3%～9.0%。乙酸和乳酸是牛欄山二鍋頭原酒中重要的風味物質，適量的乙酸和乳酸可賦予酒體酸爽感和協調感，平衡酒的苦味，提高酒的后味，同時有利于儲存過程中酒體老熟。

表3 牛欄山二鍋頭原酒中有機酸含量測定結果Table 3 Determination results of organic acids contents in base liquor of Niulanshan Erguotou mg/L

2.3 牛欄山二鍋頭原酒中有機酸分布規律分析

清蒸二次清工藝可分為大茬酒和二茬酒，其中大茬酒采用純糧發酵，高粱經過破碎、潤料、蒸煮糊化、冷散、加曲后入缸發酵30 d，上甑分段掐酒得大茬酒；大茬蒸餾后的酒醅重新加水、冷散、加曲后二次入缸發酵30 d，上甑分段掐酒得二茬酒。從表3中可以看出，原酒中的有機酸中乙酸和乳酸含量占絕對優勢，因此本研究著重對其兩個指標進行了分析，乙酸變化分析結果見圖2。

圖2 不同茬次原酒中乙酸含量比較Fig.2 Comparison of acetic acids contents in different batch of base liquor

由圖2可知，大茬酒和二茬酒在不同摘酒時間段乙酸含量的變化趨勢有差別，隨著摘酒時間的推移，大茬、二茬乙酸含量呈平緩上升曲線，乙酸在尾段含量最高。在牛欄山原酒酒頭中的乙酸為300 mg/L左右，而在后段、尾段則提高了3倍左右。原因可能是乙酸沸點較高（117.9℃），本身難蒸餾出，但酒中含有較多的醇、酯和醛類物質，乙酸與這些低沸點的化合物（乙醇為78.4℃）和水形成一定的共沸和拖帶作用，在一定程度上降低了乙酸的沸點，使得乙酸也能隨著溫度升高而逐漸餾出。

原酒中的乳酸變化分析結果見圖3。

圖3 不同茬次原酒中乳酸含量比較Fig.3 Comparison of lactic acid contents in different batch of base liquor

由圖3可知，大茬乳酸幾乎呈線性遞增，尾段酒的酸增有一個突躍；二茬酒的乳酸增加呈平緩上升曲線。在牛欄山原酒中酒頭的乳酸為60 mg/L左右，而在后段、尾段則提高了5倍左右。這主要是因為難揮發酸在溫度較低的時候難以蒸餾出[15-16]，所以越是難揮發的物質越是集中在溫度較高的后期餾出，這也解釋了隨著摘酒時間的推移，難揮發的乳酸增大的現象。

3 結論

本研究采用離子色譜技術建立了清香型白酒原酒中21種有機酸含量的分析方法。該方法標準曲線線性相關系數R2＞0.99，靈敏度高，所測樣品濃度在線性范圍之內，適合于白酒原酒中有機酸的分析檢測。采用該方法系統分析了不同類別牛欄山原酒中有機酸的種類、含量和分布規律。在牛欄山原酒中共檢出9種有機酸，主體酸類物質為乙酸和乳酸。從定量結果來看，乙酸、乳酸質量濃度在有機酸中屬于主要酸類物質，乙酸含量為233.86～2416.98mg/L，占有機酸總量的41.1%～79.3%；乳酸含量為18.34～6 504.96 mg/L，占有機酸總量的14.5%～57.5%；其他有機酸含量較低，占有機酸總量的1.3%～9.0%。

進一步分析乙酸和乳酸在不同原酒中的分布規律發現，大茬酒和二茬酒在不同摘酒時間段乙酸含量的變化趨勢有差別，隨著摘酒時間的推移，乙酸大二茬含量呈平緩上升曲線。而大茬酒的乳酸幾乎呈線性遞增，尾段酒的酸增有一個突躍；二茬酒的乳酸增加呈平緩上升曲線，這主要是由乙酸和乳酸結構決定的。