短時受精聯合R-ICSI、half-ICSI、過夜受精在不同不孕情況中的應用

史鴻志，張楠，秦妍，李偉偉，李麗瑋

(秦皇島市婦幼保健院，秦皇島 066000)

在常規體外受精-胚胎移植(IVF-ET)過程中仍然有10%～25%發生低受精或完全受精失敗的風險[1]，這種情況一旦發生，將會給醫生和患者帶來沉重的打擊。其原因是多方面的，具體機制尚不清楚。目前用于預防IVF受精失敗發生的方法，主要是部分卵胞漿內單精子注射(half-ICSI)[2]和短時受精聯合早期補救ICSI(R-ICSI)[3]。而在IVF的受精方式中，短時受精、過夜受精、half-ICSI受精的選擇還存在爭議。為了盡量降低初次IVF助孕周期受精失敗(包括完全受精失敗和受精率<30%，以下總稱受精失敗)的發生，同時盡可能根據患者的不同情況選擇對患者更有利的受精方式，我中心根據患者原發及繼發不孕類型的不同，制定了個體化的受精方案，并對臨床結局進行比較分析，以期更好地指導臨床工作。

資料和方法

一、研究對象及分組

回顧性分析2016年1月至2017年12月在我院行首次IVF助孕的周期的臨床資料，共計466個周期。除外獲卵數<4枚、卵母細胞成熟障礙者。所有患者在醫師充分告知后簽署知情同意書。

將納入對象按照不孕類型的不同進行區分，原發不孕和繼發不孕無生育史的患者分為2組，分別行短時受精聯合早期R-ICSI(A組，n=123)和half-ICSI(B組，n=45)；對單純繼發不孕患者也分為2組，分別采用短時受精聯合早期R-ICSI(C組，n=94)和過夜受精(D組，n=204)。分別比較各組患者的一般資料、受精情況、胚胎質量及妊娠結局。

二、研究方法

1.促排卵和取卵：為了減少促排卵方案帶來的差異，選擇長方案、拮抗劑方案的病例進行統計分析。促排卵藥物有注射用重組人卵泡刺激素(果納芬，默克，瑞士，75 U/支)，當1個主導卵泡直徑≥18 mm或2個≥17 mm或3個≥16 mm時，皮下注射重組人絨毛膜促性腺激素(HCG，艾澤，默克，瑞士，250 μg/支)，36 h取卵。

2.精液收集及處理：男方禁欲2～7 d，手淫法獲取精液。采用密度梯度離心法結合上游法處理精液，處理方法如下：將1 ml 80%的高濃度梯度液加入15 ml尖底離心管的底部，在上面輕輕加入1 ml 40%低濃度梯度液，在最上層輕輕加入液化后的精液，100g離心20 min；去上層液體，將沉淀轉移至含3 ml受精培養液的新離心管里充分混勻，300g離心5 min；去上清將沉淀混勻后加入圓底離心管的底部上游備用，圓底離心管的上游液體量視回收沉淀的多少調節，一般采用0.5 ml受精液作為上游液，放入6%的CO2培養箱中孵育。

3.不同授精方式及培養：(1)A組：HCG后39～40 h將卵-冠-丘復合體與精子混合，授精后5 h去除顆粒細胞，并置于新培養皿中觀察第二極體，若出現第二極體的卵母細胞占成熟卵母細胞比率(2PB率)<30%，記為低受精周期，并于1 h后再次觀察，確認第二極體排出的卵母細胞比率沒有明顯變化后，對明確1個極體的卵母細胞行R-ICSI。(2)B組：將患者的卵母細胞分為2組，分別采用常規IVF和ICSI方法授精。IVF授精：HCG后39～40 h將卵-冠-丘復合體與精子混合，培養過夜后去除顆粒細胞，觀察卵母細胞受精情況。ICSI授精：HCG后39～41 h行ICSI授精。(3)C組：方法與A組相同。D組：HCG后39～40 h將卵-冠-丘復合體與精子混合，采用中央井皿混合受精，培養過夜后去除顆粒細胞，觀察卵母細胞受精情況。

4.體外培養及胚胎發育評級：授精后18～20 h觀察原核，出現雙原核(2PN)記為正常受精，繼續體外培養至取卵后第3天對胚胎進行質量評估：根據胚胎卵裂球數目、形態、大小是否均勻及有無碎片等將胚胎分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級，其中7～9細胞的Ⅰ、Ⅱ級胚胎評為優質胚胎。

5.胚胎移植：取卵后第3天，選擇相對優質胚胎(R-ICSI及half-ICSI周期優先選擇IVF受精胚胎)進行移植。經患者充分知情同意后，新鮮移植患者剩余可用胚胎較多時，可適當冷凍2～4枚卵裂期胚胎，全胚冷凍患者一般冷凍4枚相對優質胚胎，對其余胚胎行囊胚培養。將胚胎繼續體外培養至第5～6天，對于形成的可用囊胚進行冷凍。

6.黃體支持及妊娠結局判斷：胚胎移植后予肌內注射黃體酮注射液(浙江仙琚)60 mg/d或陰道內塞黃體酮陰道緩釋凝膠(雪諾同，默克，瑞士，90 mg/支)90 mg/d，同時聯合口服黃體酮軟膠囊(浙江仙琚)100 mg/次、2次/d支持黃體功能。移植后14 d檢測血HCG水平，陽性為生化妊娠；移植后35 d超聲監測到宮內妊娠囊為臨床妊娠。

7.觀察指標：由于R-ICSI和half-ICSI周期同時存在IVF和ICSI的卵母細胞，為了便于統計計算，全部采用成熟卵母細胞作為分母。2PN率=2PN卵母細胞數/成熟卵母細胞數；2PN卵裂率=2PN卵裂數/2PN卵母細胞數；多PN率=多PN卵母細胞數/成熟卵母細胞數；ICSI卵母細胞率=ICSI助孕卵母細胞總數/成熟卵母細胞總數；優質胚胎率=優質胚胎數/2PN卵裂數；囊胚形成率=囊胚數/養囊胚胎數；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數；胚胎種植率=著床胚胎數/移植胚胎數。

三、統計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。計數資料采用百分數表示，組間比較采用χ2檢驗；符合正態分布的計量資料用(±s)表示，組間比較采用t檢驗，檢驗水準(α)為0.05。P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、各組一般情況比較

A組和B組的女方年齡、不孕年限、基礎FSH、體重指數(BMI)、內膜厚度、移植胚胎數、男方精子濃度、前向運動精子百分率等比較，均無顯著性差異(P>0.05)，但B組的獲卵數顯著高于A組(P<0.05)；C組和D組的各項指標比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

二、各組受精情況、胚胎質量及妊娠結局比較

A組低受精率、完全受精失敗率及總受精失敗率均顯著高于B組(P<0.05)，ICSI卵母細胞率顯著低于B組(P<0.05)；A、B兩組的MⅡ卵受精率、2PN率比較無顯著性差異(P>0.05)。C組的正常受精率、優質胚胎率、囊胚形成率略低于D組，多PN率略高于D組，但尚無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

三、A組中原發不孕和繼發不孕無生育史患者的受精失敗率比較

原發不孕和繼發不孕無生育史兩個亞組間比較，完全受精失敗率、低受精率和總受精失敗率均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表1 各組一般情況比較 (x-±s)

注：與A組比較，*P<0.05

表2 各組受精情況、胚胎質量及妊娠結局比較 (%)

注：與B組比較，*P<0.05；a只計算IVF授精部分卵母細胞的多PN率

表3 A組中原發不孕和繼發不孕無生育史患者受精失敗率比較 [(x-±s)，%]

討 論

原發不孕、男方精液臨界水平一般認為是受精失敗的高危因素[4-5]。在選擇受精方式時，除原發不孕外，我們將繼發不孕無生育史也列為高危因素，對這部分病人行短時受精聯合早期R-ICSI，對于獲卵數大于12枚的部分周期行half-ICSI，而對于單純繼發不孕患者行過夜受精。我們的研究中，A組總的受精失敗率顯著高于B組(P<0.05)。短時受精聯合R-ICSI避免了如此高比例的受精失敗的發生，由此可見，對原發不孕及繼發不孕無生育史的患者實施短時受精聯合R-ICSI預防受精失敗發生的作用是明顯的，與劉蘭蘭等[6]學者的研究一致。同時我們比較了短時受精聯合R-ICSI組中原發不孕和繼發不孕無生育史的患者兩組間受精失敗的發生率(表3)，發現兩組間受精失敗的發生率無統計學差異，可見在我們的研究中繼發不孕無生育史的不孕患者也是受精失敗發生的高危人群，這類患者對A組中受精失敗的發生沒有產生影響。

與劉苡萱等[7]、朱琴等[8]的研究不盡相同，我們發現原發不孕和繼發不孕無生育史的患者中half-ICSI預防初次IVF助孕周期受精失敗發生的作用并不明顯，受精失敗的發生率較低，45個周期只發生1例IVF完全受精失敗，無低受精的發生。但half-ICSI增加了過度ICSI的風險，ICSI卵母細胞率遠高于短時受精聯合R-ICSI組(50.89% vs.16.02%，P<0.05)，兩組間受精率、胚胎質量及妊娠結局方面比較則沒有顯著性差異。出現這種結果的原因我們考慮可能與half-ICSI的周期普遍取卵較多，卵巢功能較好，取到的卵母細胞質量較好有關。然而half-ICSI組中樣本數較少，具有一定的局限性，且由于是回顧性研究，研究結果可能存在偏倚，后續還需要大數據的支持論證。此外，有學者回顧性分析half-ICSI中常規IVF完全受精失敗的周期與短時IVF聯合R-ICSI兩種授精方式的助孕結局，發現兩組ICSI部分受精率、優質胚胎率及妊娠率差異無統計學意義[9]，提示half-ICSI中IVF卵母細胞受精失敗與R-ICSI相比降低了卵母細胞利用率。因此，建議在初次IVF助孕周期選擇half-ICSI時需要慎重考慮，或者直接采用短時聯合R-ICSI更為合適，這與劉琨等[10]的研究一致。

單純繼發不孕患者短時受精和過夜受精兩種授精方式在受精情況、胚胎質量及妊娠結局上沒有顯著性差異。兩種受精方式發生受精失敗的比率很低，短時受精聯合R-ICSI組94個周期發生2例受精失敗，受精失敗率2.13%；過夜受精組204周期無1例完全受精失敗發生，低受精發生4例，受精失敗率1.96%，組間比較無統計學差異。值得注意的是，過夜受精組沒有因為增加精子與卵母細胞的作用時間導致細胞代謝產物及過氧化物增加，而對胚胎后續發育產生明顯影響[11-12]，反而在2PN受精率、優質胚胎率、囊胚形成率、多PN受精率等指標上有優于短時受精聯合R-ICSI組的趨勢，但尚無統計學差異(P>0.05)，與之前一些研究報道[13-14]相似。其可能因為過夜受精減少了體外操作和暴露時間，一些卵母細胞在過夜培養過程中胞質和細胞核達到了更好的成熟狀態，且在一個合適的受精濃度范圍內，精卵作用時間的延長并不產生負面的影響，反而為卵母細胞提供了更多的優質精子選擇。因此對單純繼發不孕的患者首次行IVF助孕時，在患者充分知情同意并理解的前提下，采用過夜受精仍是值得肯定的方法之一。

本研究中，466個周期總受精失敗周期為27個，發生率為5.79%，略低于之前學者報道的10%～25%[1]，與Liu等[15]研究相近，可能是因為我們統計時去掉了獲卵數少于4個和卵母細胞發育障礙的周期，而這些周期是受精失敗的高發周期。由此可見，IVF過程中，發生受精失敗的比率還是較高的，如何權衡預防受精失敗和獲得更好的受精結局就需要生殖醫學科的醫生綜合評估后做出有利決定。

綜上所述，對于原發不孕及繼發不孕無生育史的患者，短時IVF聯合R-ICSI能很好地預防受精失敗的發生，提高了本周期卵母細胞的利用率。對于單純繼發不孕患者，過夜受精的結局似乎比短時受精更有優勢，仍然是值得肯定的授精方式之一。生殖醫生應在盡可能避免受精失敗的同時，使患者獲得更好的妊娠結局，實行個體化的受精方式也正是基于此點考慮。