長白山野生軟棗獼猴桃總黃酮提取工藝的優化

彭雪，劉振春，張悅，周瑾琨

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118）

野生軟棗獼猴桃（Actinidia arguta Sieb.et Zucc.），俗名軟棗子、獼猴梨、藤瓜，屬于獼猴桃科（Actinidiaceae），獼猴桃屬（Actinidia）多年生落葉藤本植物[1-4]。分布于我國吉林省、黑龍江省、山東省及華北、西北地區。每年8月～9月成熟，是長白山區著名的經濟野果之一，是珍貴的野生果中之王，其顏色翠綠，細嫩多汁，風味獨特，酸甜適口，被譽為“世界之珍果”。野生軟棗獼猴桃果實營養豐富，富含多種功能性成分，如氨基酸、維生素及黃酮等，是開發功能保健食品的絕佳原料[5-10]。黃酮類化合物是長白山野生軟棗獼猴桃的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗病毒、防治心腦血管疾病、保肝護肝以及提高機體免疫力等生理功能[11-14]。

提取軟棗獼猴桃中的黃酮主要用乙醇提取法[15]。也有研究者使用超聲波或微波輔助溶劑提取法[16]，可有效提高軟棗獼猴桃中黃酮的得率。由于提取長白山野生軟棗獼猴桃需要消耗大量的提取劑，生產成本較高，急需優化長白山野生軟棗獼猴桃中總黃酮的提取工藝，提高其得率，降低生產成本。本試驗利用乙醇溶液作為提取劑，采用超聲波微波協同技術提取總黃酮，旨在減少溶劑用量，提高生產效率，為長白山野生植物資源的綜合利用和開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長白山野生軟棗獼猴桃：吉林省通化市（9月份采摘）。

蘆丁標準品：中國藥品生物制品鑒定所；無水乙醇、石油醚、NaNO2、NaOH、Al（NO3）3：分析純，沈陽化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

FZ102型微型植物式樣粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；FA2104型電子分析天平：上海精密科學儀器有限公司天平儀器廠：TDL-4型離心器：上海安亭科學儀器廠；TU-1901型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；JY99-2D超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；UWave-1000微波-紫外-超聲波三位一體合成萃取反應儀：上海新儀微波化學科技有限公司；LG 0.2型真空冷凍試驗機：沈陽航天新陽速凍設備制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 長白山野生軟棗獼猴桃鮮果預處理

將新鮮長白山野生軟棗獼猴桃用蒸餾水洗凈并于0.55%抗壞血酸溶液中浸泡15 min[17]，瀝干搗碎后，65℃真空冷凍干燥至恒重，粉碎過篩，制得軟棗獼猴桃干粉。準確稱取一定量粉粹過篩的軟棗獼猴桃粉于燒杯中，加入60%乙醇溶液，在超聲波微波設備中，于不同條件下提取野生軟棗獼猴桃黃酮。將浸提后的萃取液于4 000 r/min離心10 min，收集上清液，定容至10 mL，得到長白山野生軟棗獼猴桃黃酮提取液。

1.3.2 黃酮標準曲線的建立

黃酮含量的測定方法采用Al（NO3）3-NaNO2顯色法[18-19]進行含量測定，內容稍作修改。精確稱取10 mg蘆丁標準品，以30%乙醇定容至50 mL，搖勻。分別準確吸取蘆丁標準溶液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于7個10 mL比色管中，加入0.2 mL 5%NaNO2，搖勻靜置6 min，再加入0.2 mL 10%Al（NO3）3，搖勻靜置6 min，然后加入2.0 mL 4%NaOH，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻靜置15 min后，在波長510 nm處測定吸光度，并以蘆丁標準品濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程為：y=0.292 1x+0.003 5，R2=0.999 8，由數據可以分析得出標準品具有良好的線性關系。

1.3.3 長白山野生軟棗獼猴桃黃酮含量的測定

取1.0 mL長白山野生軟棗獼猴桃提取液加入10 mL比色管中，加入0.2 mL 5%NaNO2，搖勻靜置6 min，再加入0.2 mL 10%Al（NO3）3，搖勻靜置6 min，然后加入2.0 mL 4%NaOH，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻靜置15 min后，在波長510 nm處測定吸光度，代入標準曲線，按下式求得比色管中長白山野生軟棗獼猴桃黃酮得率。

式中：C為長白山野生軟棗獼猴桃總黃酮質量濃度，g/mL；N為稀釋的倍數；M為稱取長白山野生軟棗獼猴桃粉末的質量，g；V為提取液體積，mL。

1.3.4 單因素試驗

準確稱取5.000 g長白山野生軟棗獼猴桃粉末，在乙醇濃度為60%條件下，分別研究不同的液料比、超聲功率、超聲處理時間、微波功率、微波處理時間對長白山野生軟棗獼猴桃黃酮得率的影響。提取的基本條件是：60%的乙醇溶液作為提取劑、液料比25∶1（mL/g）、超聲與微波溫度控制在70℃以內、超聲功率350 W、超聲處理時間7 min、微波處理功率360 W、微波處理時間336 s。各因素水平為：超聲波功率200、250、300、350、400、450、500 W；超聲處理間 4、5、6、7、8、9、10 min；微波功率 240、300、360、420、480、540、600 W；微波處理時間 48、144、240、336、432、528、624 s。

1.3.5 響應面優化試驗方案

采用響應面法進行試驗數據處理，選用Box-Behnken模型對影響超聲-微波協同技術提取長白山野生軟棗獼猴桃黃酮得率的因素進行響應面設計，以得率為響應值進行優化。

1.3.6 數據處理與統計分析

試驗操作重復3次取平均值，計算標準誤差并制圖分析。試驗方案設計和模型構建采用Design Expert 8.0.6軟件，數據處理采用Origin Pro 8.5進行，統計分析采用SPSS 18.0軟件中的單因素ANOVA進行，顯著性水平為P＜0.05，高度顯著為P＜0.01，極顯著為P＜0.001。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 超聲功率對黃酮得率的影響

超聲功率對黃酮得率的影響見圖1。

由圖1可知，超聲功率對黃酮得率產生了比較明顯的影響，隨著超聲功率的增大而增加，但當功率超過350 W后，黃酮得率下降，故選用超聲功率為350 W。這種現象與其它報道類似[20-22]。由SPSS 18.0數據分析軟件分析，P＜0.05，說明超聲功率對黃酮得率影響差異顯著。

圖1 超聲功率對黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the yield

2.1.2 超聲時間對黃酮得率的影響

超聲時間對黃酮得率的影響見圖2。

圖2 超聲時間對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the yield

由圖2可見，超聲時間對長白山野生軟棗獼猴桃黃酮得率影響較小，隨著時間的延長，黃酮得率不斷增加，當時間為7 min時，得率最高，超過7 min后，黃酮得率略有下降，故選擇7 min為提取黃酮的超聲時間。在一些報道中不同原材料提取總黃酮也觀察到類似現象[23]。根據SPSS 18.0數據分析軟件處理知，P＞0.05，說明超聲時間對黃酮得率影響不顯著。

2.1.3 液料比對黃酮得率的影響

液料比對黃酮得率的影響見圖3。

由圖3可知，在試驗選取的液料比范圍內，提取液用量少時得率較小，隨著提取液用量的增加，得率呈逐漸上升的趨勢[24]，但當液料比到 25 ∶1（mL/g）后，得率逐漸下降，從節約成本的角度考慮，選擇液料比為 25 ∶1（mL/g），根據 SPSS 18.0 軟件分析，P＜0.05，液料比對長白山野生軟棗獼猴桃黃酮得率有顯著性的影響。

圖3 液料比對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the yield

2.1.4 微波功率對黃酮得率的影響

微波功率對黃酮得率的影響見圖4。

圖4 微波功率對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of microwave power on the yield

由圖4可知，當微波功率為360 W時，得率最大，超過360 W，可能由于強烈的熱效應使有效成分遭到破壞，導致得率降低，因此，選取微波功率為360 W。這一變化趨勢與杜廣芬等[25]報道相似。根據SPSS 18.0數據分析軟件處理知，P＜0.05，說明微波功率對長白山野生軟棗獼猴桃黃酮得率影響顯著。

2.1.5 微波時間對黃酮得率的影響

微波時間對黃酮得率的影響見圖5。

由圖5可以看出，在微波處理時間為48 s～336 s范圍內時，由于細胞壁破裂程度不斷增加，336 s時，細胞破裂程度達到最大，從而使野生軟棗獼猴桃黃酮得率緩慢上升，在225 s后，野生軟棗獼猴桃細胞壁基本破壁完全，同時由于持續的加熱破壞了軟棗獼猴桃黃酮成分，而使得率下降，所以選微波時間為336 s（即微波處理7次，每次48 s）。這一變化趨勢與文獻[26]報道的相似。由SPSS 18.0數據分析軟件分析，P＜0.01，說明微波時間對野生軟棗獼猴桃黃酮得率影響高度顯著。

圖5 微波處理時間對黃酮得率的影響Fig.5 Effect of microwave treatment time on yield

2.2 Box-Behnken試驗設計與結果

由單因素試驗結果可知，不同試驗因素對長白山野生軟棗獼猴桃黃酮得率的影響有所不同。對單因素試驗結果的方差分析發現：超聲波功率、液料比、微波功率、微波時間對黃酮得率的影響均為顯著。因此，選用以上因素作為試驗因素，設計Box-Behnken試驗以優化提取條件，以黃酮得率為評價指標，確定超聲波-微波協同法提取長白山野生軟棗獼猴桃中黃酮的較適條件。

2.2.1 回歸模型的建立與顯著性分析

Box-Behnken試驗方案與結果如表1所示。利用統計軟件Design-Expert 8.06對表1中所得的數據進行分析，方差分析結果見表2。

表1 Box-Behnken試驗設計及結果Table 1 Design and results of Box-Behnken experiments

續表1 Box-Behnken試驗設計及結果Continue table 1 Design and results of Box-Behnken experiments

表2 Box-Behnken試驗結果方差分析Table 2 ANOVA of Box-Behnken experimental results

因素經回歸擬合，得到如下四元二次回歸方程為：Y=7.33+0.18A+0.075B+0.13C-0.11D-0.077AB-0.058AC+0.065AD+0.028BC-0.22BD+0.37CD-0.22A2-0.45B2-0.36C2-0.16D2。

由表2回歸模型方差分析可知，回歸模型P值均小于0.000 1，達到了極顯著水平，說明該模型顯著回歸，方程能夠正確反映長白山野生軟棗獼猴桃黃酮得率與各因素之間的關系。模型的失擬項P=0.632 3＞0.1，不顯著，說明此回歸模型與實際情況擬合得很好，試驗誤差小，不存在其他未考慮到的因素。模型中一次項 A、B、C、D，二次項 A2、B2、C2、D2和交互項 BD、CD表現為差異極顯著，說明這幾個因素對黃酮得率影響極大，且所考慮因素對響應值影響不是簡單的一次線性關系。AB為差異高度顯著，交互項除AC、BC不顯著。根據F值大小，可知影響因素的主次順序為：A＞C＞B＞D，即超聲波功率＞微波時間＞微波功率＞液料比。該回歸模型的校正決定系數R2Adj=0.962 1，表明有96.21%的得率變異分布在所研究的4個相關因素中；決定系數為R2=0.981 1，表明實測值與預測值間有很好的擬合度。方差分析結果表明采用響應面法設計所得的回歸模型有效，可適用于長白山野生軟棗獼猴桃黃酮提取試驗的理論預測。

2.2.2 響應面分析法對長白山野生軟棗獼猴桃黃酮提取工藝的優化

兩因素交互作用對黃酮得率的影響的響應面見圖6。

圖6 兩因素交互作用對黃酮得率的影響的響應面Fig.6 Response surface of the effect of two-factor interaction on flavone yield

如圖6的a、e、f所示的響應面為開口向下的凸形曲面，均有極高值，超聲波功率、微波功率和微波時間方向的曲面坡度陡峭，且超聲波功率方向的曲面坡度與微波功率方向相比更為陡峭（圖6a），微波功率方向的曲面坡度與液料比相比更為陡峭（圖6e），微波時間方向的曲面坡度與液料比相比更為陡峭（圖6f），說明黃酮得率對超聲波功率、微波功率和微波時間對這3個因素的變化敏感，且對超聲波功率的變化更為敏感。圖6a、圖6b、圖6c的曲面圖的陡峭程度顯示，可得出：超聲波功率對黃酮得率的影響要大于微波功率、微波時間與液料比。同理，圖6d響應面圖顯示微波時間對黃酮得率的影響要大于微波功率。再次驗證了單因素與交互項對黃酮得率的影響的主次順序。

2.2.3 提取工藝的優化與驗證

經Design-Expert 8.0.6分析優化，可得到超聲波-微波協同法提取長白山野生軟棗獼猴桃總黃酮的最佳工藝條件為液料比25∶1（mL/g）、超聲波功率350 W、微波功率360 W、微波時間336 s。在此條件下，根據方程得到黃酮得率的預測值為7.33%。為了驗證響應面優化的可行性，采用優化后的提取條件進行5次平行試驗。結果見表3。

表3 優化條件下的黃酮得率Table 3 Under the optimal conditions of flavonoid yield

結果表明，采用上述優化條件提取時，黃酮得率是7.33%，預測值與試驗值的相對偏差在0.002%左右，說明Design-Exper軟件響應面試驗設計有效的對超聲波微波協同提取黃酮的工藝參數進行了優化，證明在實踐中應用該模型進行預測是可行的，具有一定的應用價值。采用超聲波-微波協同法提取長白山野生軟棗獼猴桃總黃酮的得率明顯高于孫寧寧[15]的溶劑浸提法，說明采用超聲波-微波協同法提取效果較好。

3 結論

響應面優化超聲波-微波協同法提取長白山野生軟棗獼猴桃總黃酮的最佳工藝條件為液料比25∶1（mL/g）、超聲功率 350 W、微波功率 360 W、微波時間336 s，在此條件下黃酮得率為（7.33±0.002）%，與孫寧寧[15]的傳統溶劑浸提法相比提高了3.47%。此研究對提高長白山野生軟棗獼猴桃野生資源充分利用及經濟價值，同時促進長白山野生資源產業的發展具有重要意義。