響應面法優化山葵酸菜加工工藝的研究

李杰，羅倩，張琴萍，鄔曉勇，孫雁霞

（成都大學藥學與生物工程學院，四川成都610106）

山葵（Wasabi）一種綠色高山植物，植株高約為20公分～50公分，具有一種特殊的辛辣味及香氣。一般生長在原始森林里，被譽為“綠色黃金”、“東方山葵”。在原野山谷流水等相對陰濕環境中栽培出的山葵品質最好，是加工各類山葵產品的適宜原料。山葵的各種保健作用也在近年來越來越受到人們的重視[1]。人體各組織器官的損傷主要來源于氧化，Shin S和Korenori Y的研究都表明了山葵的抗氧化作用[2-3]；山葵風味物質的刺激作用，也可促進脂肪的消耗，從而達到減肥和預防肥胖癥的作用[4-5]；Aoyagi S[6]研究發現山葵中的黑芥子硫甘酸鉀具有一定的抗癌作用。一直都有對于山葵產品的研發，昝加志等[7]研發出一款新型的山葵抑菌口香糖，山葵特殊的辛辣味可以用于制作一款特殊風味的山葵調味醬[8]。響應面法也早用于山葵以及山葵產品加工工藝的研究，劉艷全等[9]使用響應面法對山葵異硫氰酸酯制備工藝進行優化，林艷如等[10]使用響應面法對山葵葉柄調味菜防腐工藝進行優化。

酸菜是我國傳統的發酵蔬菜制品，有著近千年的歷史[11]。但普通酸菜因為使用鹽漬方式進行發酵，因此大部分酸菜中含有一定量的亞硝酸鹽，長期食用含亞硝酸鹽的食品會導致消化系統癌癥[12]。因此尋找一種更為經濟安全的腌制工藝，必將促進酸菜行業的發展。采用面湯水[13]發酵工藝加工山葵酸菜，可以有效的增加山葵中異硫氰酸酯的穩定性，同時降低酸菜中亞硝酸鹽含量。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺鹽酸鹽、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、酚酞（均為國產分析純）：天津市光復科技發展有限公司。

UV5100B型紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；JA3103N型電子天平：上海明橋精密科學儀器有限公司；HH-6型數顯恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司。

1.2 山葵酸菜中亞硝酸鹽含量測定

按照GB 5009.33-2016《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中分光光度法測定山葵酸菜的亞硝酸鹽含量。

1.3 山葵酸菜加工工藝流程

參考民間酸菜加工工藝[14]和劉夏薇以及謝玉鵬對新產品酸菜工藝研究[15-16]并結合山葵中特殊風味物質異硫氰酸酯的特性，確定山葵酸菜工藝流程如下：

山葵花苔→原料選取→切制→清洗→漂燙→面湯水發酵→包裝→巴氏滅菌→冷卻→包裝→檢驗→成品

1.4 山葵酸菜的感官評價標準

在經過多次試驗后，制得感官、性狀等存在明顯差異的產品，為了能較公正有效地判斷制得的山葵酸菜品質的好壞，在山葵酸菜自身特性的基礎上，結合趙國忠、趙丹對酸菜品質研究中酸菜感官評價標準[17-18]，最終從色澤（20分）、滋味（35分）、組織狀態（30分）和氣味（15分）4個方面，分別設立評分標準，來有效地對山葵酸菜產品感官品質進行綜合評比，感官質量評分標準見表1。

表1 山葵酸菜感官評定指標和評分參考Table 1 The sensory evaluation index and grading reference of Wasabi sauerkraut

感官評定方法：取適量樣品放入潔凈的瓷盤中，在充足的自然光下觀察其色澤、組織形態、檢查有無外來雜質，并嗅其氣味、嘗其滋味。由10人組成感官評定小組，分別山葵酸菜的色澤（20分）、滋味（35分）、組織狀態（30分）和氣味（15分）進行評分，取其平均值作為山葵酸菜感官評定的最后得分。

1.5 山葵酸菜中總酸（以乳酸計）含量的測定

按照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》中的酸堿中和滴定法進行測定。

1.6 單因素試驗設計

經過多次預試驗確定，分別考察發酵面湯水比例（4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%）、腌制時間（12、16、20、24、28、32、36 h）、腌制溫度（10、15、20、25、30、35、40℃）對山葵酸菜感官品質和總酸含量的影響。

1.7 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，利用響應面分析軟件Design Expert 8.06中的Box-Behnken程序，設計腌制面湯水比例、腌制溫度、腌制時間三因素三水平的試驗，最終通過響應面試驗結果確定山葵酸菜的最佳腌制發酵條件。

2 結果分析

2.1 亞硝酸鹽標準曲線

按照GB 5009.33-2016中分光光度法得到亞硝酸鹽標準曲線如圖1。

得到的亞硝酸鹽標準曲線方程為y=0.027 7x-0.000 2，R2=0.999 9，擬合度較高。

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 腌制面湯水的比例對山葵酸菜感官品質和總酸含量的影響

對不同比例面湯水發酵腌制的山葵酸菜進行感官評價和總酸含量測定，結果見圖2、圖3。

圖2 不同面湯水比例腌制山葵酸菜感官評分Fig.2 The sensory score of Wasabi sauerkraut with different proportion of noodle soup

圖3 不同面湯水比例腌制山葵酸菜中總酸含量Fig.3 The total acid content of Wasabi sauerkraut with different proportion of noodle soup

由圖2可知選用面粉含量為7%的面湯水對山葵葉柄和花苔進行腌制，制得的山葵酸菜達到感官評分最高，在面湯水過低或者過高都會逐漸降低山葵酸菜的感官品質。從圖2可以得出，對山葵酸菜滋味影響因素最顯著的為面湯水比例，在山葵酸菜的腌制過程中，如果面湯水比例過低，將使得山葵花苔得不到充分的腌制發酵，從而影響山葵酸菜的滋味；當面湯水比例過高不僅會降低山葵酸菜自身的滋味，同時由于面湯水比例過高，會使山葵酸菜的色澤降低，進而降低山葵酸菜的感官品質。由圖3可知，選用面粉含量為7%的面湯水對山葵進行腌制，制得的山葵酸菜的總酸含量最高。因此在山葵酸菜腌制發酵工藝優化中選擇面湯水比例7%作為響應面優化試驗中心點。

2.2.2 腌制時間對山葵酸菜感官品質和總酸含量的影響

對不同腌制時間制得的山葵酸菜進行感官評價和總酸含量測定，結果見圖4、圖5。

圖4 不同腌制時間腌制山葵酸菜感官評分Fig.4 The sensory score of Wasabi sauerkraut with different curing time

圖5 不同腌制時間腌制山葵酸菜中總酸含量Fig.5 The total acid content of Wasabi sauerkraut with different curing time

由圖4可知，腌制時間為24 h制得的山葵酸菜感官評分最高。從圖4可以明顯看出，在腌制時間逐漸增加的過程中，山葵酸菜的各項感官品質都在逐漸增加。但當腌制時間超過24 h后，山葵酸菜的各項感官品質就會降低，其中最明顯的表現為組織形態的急劇變壞，原因可能為腌制時間過久，使得山葵的花苔和葉慢慢的開始變軟，甚至腌制時間更久之后，山葵酸菜會出現軟爛的現象。由圖5可知，從腌制時間12 h到24 h，總酸含量上升趨勢明顯；當腌制時間超過24 h后，總酸含量上升趨勢逐漸平緩。因此在山葵酸菜腌制發酵工藝優化中選擇發酵時間24 h作為響應面優化試驗中心點。

2.2.3 腌制溫度對山葵酸菜感官品質和總酸含量的影響

對不同腌制溫度制得的山葵酸菜進行感官評價和總酸含量測定，結果見圖6、圖7。

圖6 不同腌制溫度腌制山葵酸菜感官評分Fig.6 The sensory score of Wasabi sauerkraut with different curing temperature

圖7 不同腌制溫度腌制山葵酸菜中總酸含量Fig.7 The total acid content of Wasabi sauerkraut with different curing temperature

由圖6可知將山葵酸菜置于25℃下進行發酵，制得的山葵酸菜感官評分最高。由圖7可知，在腌制溫度為25℃時，山葵酸菜中總酸含量達到最高。從圖中還可發現溫度超過25℃后總酸含量降低，造成這種現象的原因可能是高溫抑制了乳酸菌的代謝活動，從而使總酸含量降低。因此山葵酸菜腌制發酵過程中選擇腌制溫度25℃作為響應面優化試驗中心點。

2.3 響應面試驗結果分析

2.3.1 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，利用響應面分析軟件Design Expert 8.06中的Box-Behnken程序，設計腌制面湯水比例為6%、7%、8%，腌制溫度為20、25、30℃，腌制時間為20、24、28 h三因素三水平的試驗，最終通過響應面試驗結果確定山葵酸菜的最佳腌制發酵條件。

本試驗總共有17個試驗點，12個分析試驗點，5個中心試驗點。因素水平見表2，得到的山葵感官評分和總酸含量結果見表3。

表2 Box-Behnken試驗因素水平Table 2 Box-Behnken experimental factor level

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Box-Behnken experimental design arrangement and results

使用軟件Design Expert 8.06對表3中的數據進行回歸擬合分析，最終得到的回歸模型方程為：

感官評分=98.047＋0.242A－1.057B－3.206C－1.109AB＋3.834AC＋0.221BC－10.495A2－7.225B2－7.880C2

總酸含量=1.856 4＋0.035 4A－0.071 4B＋0.105 3C＋0.038 3AB+0.053 5AC-0.068 5BC-0.343 1A2-0.329 6B2-0.002 3C2

2.3.2 模型方差分析

感官評分回歸模型方差分析見表4，總酸含量回歸模型方差分析見表5。

表4 感官評分回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance for the fifi tted quadratic polynomial model with the sensory score

表5 總酸含量回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance for the fifi tted quadratic polynomial model with the total acid content

由表4和表5可知，兩個模型具有極高的顯著性（P＜0.001），變量對于響應值的影響都表現為顯著或極顯著。失擬項P＞0.05，表現為不顯著，這表明設計模型具有良好的擬合性，因此可以使用此模型對于山葵酸菜腌制發酵過程中的工藝參數進行分析和預測。

2.3.3 響應面分析

將回歸模型中的任意一因素固定在一個水平，就可以得到另外兩個變量因素對山葵酸菜感官評分和總酸含量的交互影響結果。

2.3.3.1 感官品質響應面分析

腌制面湯水比例、腌制時間、腌制溫度對山葵酸菜感官評分的交互影響如圖8～圖10。

圖8 腌制面湯水比例和腌制溫度對感官評分交互影響的響應面圖和等高線圖Fig.8 The response surface plot and contour plot of interaction between proportion of noodle soup and curing temperature with the sensory score

圖9 腌制面湯水比例和腌制時間對感官評分交互影響的響應面圖和等高線圖Fig.9 The response surface plot and contour plot of interaction between proportion of noodle soup and curing time with the sensory score

圖10 腌制溫度和腌制時間對感官評分交互影響的響應面圖和等高線圖Fig.10 The response surface plot and contour plot of interaction between curing temperature and time with the sensory score

由圖8中的等高線圖呈現橢圓形可以看出腌制面湯水比例和腌制溫度有一定的交互作用，但是交互作用并不顯著，并且沿A軸等高線相對密集一些，這說明對山葵酸菜感官品質的影響腌制面湯水比例比腌制溫度大一些。從三維立體圖中可以看出，感官評分出現最大值出現在腌制面湯水比例和腌制時間都在中心部分的位置。由圖9的三維立體圖中可以看出，隨著腌制面湯水比例的增加，感官評分呈現一個拋物線趨勢；并且在腌制時間增加時，拋物線的頂點也呈現一個拋物線趨勢，這說明山葵酸菜感官品質的極大值出現在腌制面湯水比例和腌制時間都處于中心點附近的位置。由圖10中的等高線圖中腌制溫度和腌制時間等高線密集程度基本相同可以看出腌制溫度和腌制時間的交互作用并不顯著。

2.3.3.2 總酸含量響應面分析

腌制面湯水比例、腌制時間、腌制溫度對山葵酸菜感官評分的交互影響結果如圖11～圖13所示。

圖11 腌制面湯水比例和腌制溫度對總酸含量交互影響的響應面圖和等高線圖Fig.11 The response surface plot and contour plot of interaction between proportion of noodle soup and curing temperature with the total acid content

圖12 腌制面湯水比例和腌制時間對總酸含量交互影響的響應面圖和等高線圖Fig.12 The response surface plot and contour plot of interaction between proportion of noodle soup and curing time with the total acid content

圖13 腌制時間和腌制溫度對總酸含量交互影響的響應面圖和等高線圖Fig.13 The response surface plot and contour plot of interaction between curing temperature and time with the total acid content

由圖11中的等高線圖中腌制溫度和腌制時間等高線密集程度基本相同可以看出腌制面湯水比例和腌制溫度的交互作用并不顯著，這一點從三維立體圖中兩者的變化曲面變化趨勢相差不大也可以證明。由圖12中的等高線圖可以看出腌制面湯水比例和腌制時間的交互作用比較顯著，并且沿A軸等高線更密集，這說明對山葵酸菜總酸含量的影響腌制面湯水比例比腌制時間更大。由圖13三維立體圖中可以看出，隨著腌制溫度增加，總酸含量趨勢呈現拋物線趨勢，這可能是在低溫時，隨著溫度的增加，使山葵酸菜中的乳酸菌的代謝活動更加活躍從而使山葵酸菜中的總酸含量增加；在溫度過高時，高溫對乳酸菌的代謝作用抑制過強，從而降低了山葵酸菜中的總酸含量。

2.3.4 腌制發酵工藝的優化和可靠性驗證

通過對響應面三維立體圖和等高線圖進行分析，可以基本確定腌制發酵工藝的最佳工藝參數的范圍。并且通過軟件優化功能以山葵酸菜感官評分為主要指標對工藝參數進行優化得到最佳工藝條件為：腌制面湯水比例為6.98%，發酵溫度為24.62℃，腌制時間為23.76 h。此工藝條件下生產出來的山葵酸菜理論上感官評分能達到98.45分，總酸含量為1.836 g/100 g。考慮到實際生產中的便利，將得到的最佳工藝條件調整為：腌制面湯水比例為7%，發酵溫度為25℃，腌制時間為24 h。以此工藝條件為山葵酸菜的腌制工藝，進行3次平行試驗，最終得到的山葵酸菜感官評分為98分，總酸含量為1.869 g/100 g。從理論值與實際值對比可以發現兩者非常接近，說明此模型能較好的模擬山葵酸菜腌制發酵工藝，并能預測出最終得到山葵酸菜的感官品質與總酸含量。

2.3.5 山葵酸菜中亞硝酸鹽含量結果分析

利用優化后工藝所得的山葵酸菜，按照GB 5009.33-2016試樣處理方法進行處理，得到山葵酸菜試樣于波長538 nm處測吸光度（重復3次），并計算山葵酸菜中亞硝酸鹽含量，結果表明未檢出亞硝酸鹽。

3 結論

本文以山葵酸菜的腌制發酵工藝為主要研究對象，以山葵葉柄和花苔為原料采用響應面法對山葵酸菜的加工工藝流程進行優化。最后通過響應面試驗得到最佳腌制工藝為：腌制面湯水比例為6.98%，發酵溫度為24.62℃，腌制時間為23.76 h。考慮到實際生產中的便利，將得到的最佳工藝條件調整為：腌制面湯水比例為7%，發酵溫度為25℃，腌制時間為24 h。以此工藝條件得到的山葵酸菜感官評分為98分，總酸含量為1.869 g/100 g，產品中未檢出亞硝酸鹽。通過對山葵酸菜加工工藝的優化，用面湯水發酵工藝，有效的減少山葵酸菜中亞硝酸鹽有害成分的含量，形成一款具有山葵特色風味的山葵酸菜，在極大的提高了山葵原材料利用率和山葵附加值的同時，也提升了山葵酸菜的品質和安全性。