白喉和破傷風類毒素抗原ELISA檢測方法的建立

譚亞軍，夏德菊，李喆，晁哲，田霖，董國霞，侯啟明，馬霄

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白喉和破傷風類毒素抗原ELISA檢測方法的建立

譚亞軍，夏德菊，李喆，晁哲，田霖，董國霞，侯啟明，馬霄

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院百白破疫苗與毒素室/衛生部生物技術產品檢定方法及其標準化重點實驗室

建立定量檢測白喉和破傷風類毒素抗原的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）方法。

分別采用白喉、破傷風單抗包被酶標板，兔抗白喉、破傷風多抗作為二抗，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 IgG 抗體作為酶標抗體，以平行線法建立定量檢測白喉和破傷風類毒素抗原含量的夾心 ELISA 法，并進行方法學驗證。

兩種定量檢測 ELISA 方法的驗證結果均符合規定。檢測白喉類毒素抗原 ELISA 方法的定量限為 8.90 ×10-4Lf/ml，回收率為 98.35%，批內變異系數（CV）≤ 10.59%，批間 CV ≤ 13.51%；檢測破傷風類毒素抗原 ELISA 方法的定量限為 2.13 × 10-3Lf/ml，回收率為 107.28%，批內 CV ≤ 13.96%，批間 CV ≤ 10.06%。

建立了白喉、破傷風類毒素抗原 ELISA 檢測方法，該法特異性強、準確度高、重復性好，可用于白喉破傷風疫苗產品的質量控制和生產過程控制。

白喉； 破傷風； 抗原； 白喉-破傷風菌苗； 酶聯免疫吸附測定

白喉和破傷風疫苗作為計劃免疫品種，在我國得到了廣泛應用，可以有效預防白喉、破傷風疾病，疫苗的基礎組成分別是白喉類毒素（diphtheria toxoid，DT）和破傷風類毒素（tetanus toxoid，TT）。兩種疫苗的生產工藝基本相同，方法較為傳統，均為細菌在適宜的培養基中培養，產生的毒素經精制、甲醛脫毒成類毒素，再加入鋁佐劑吸附制成。除作為疫苗使用外，近年隨著國內外細菌多糖蛋白結合疫苗的發展，類毒素因其良好的免疫原性已成為應用最多的蛋白載體[1-2]。

目前的 2015 年版《中國藥典》三部規定白喉和破傷風類毒素抗原含量的檢測方法是采用絮狀沉淀法[3]，以絮狀單位（flocculation units，Lf）表示，該方法操作較為復雜，人工終點判斷較難掌握。我們利用類毒素免疫新西蘭大白兔制備多抗，半固體培養基法制備單克隆抗體，以平行線法建立了白喉和破傷風類毒素的夾心酶聯免疫測定法。該方法可用于白喉破傷風疫苗的鑒別試驗、組分含量測定、吸附度測定等質量控制項目以及疫苗生產過程監測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標準品 白喉類毒素國際標準品（02/176）和破傷風類毒素國際標準品（04/150）由英國國家生物制品檢定所提供[4]。

1.1.2 實驗動物 BALB/c 小鼠由中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所提供，生產許可證號 SYXK（京）2016-0004，飼養于獨立通氣動物籠環境。

1.1.3 主要試劑及儀器 辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 IgG 為美國 Life Technologies 公司產品；96 孔酶標板為德國 Greiner 公司產品；底物鄰苯二胺（OPD）、牛血清白蛋白（BSA）為美國 Sigma 公司產品；其他試劑為國產分析純；Spectramax PLUS 酶標儀為美國 Molecular Devices 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 單抗的制備和純化 用白喉、破傷風抗原加弗氏完全佐劑，經皮下注射 8 周齡BALB/c 雌性小鼠，每種抗原免疫 5 只小鼠，30 μg/只，3 周后，再以 30 μg/只抗原加弗氏不完全佐劑經腹腔注射小鼠，7 ~ 10 d 后眼眶取血，采用間接 ELISA 法檢測血清抗體效價，每種抗原分別取效價最高且大于 1:104的小鼠進行細胞融合。第二次免疫 3 周后，于融合前 3 天經尾靜脈注射抗原30 μg/只加強免疫。無菌采取小鼠的脾臟細胞與對數期生長的 SP2/0 細胞按 5:1 ~ 10:1 比例，用常規方法進行細胞融合[5]，將融合后的細胞與 1.1% 甲基纖維素培養液混勻，鋪入 6 孔板中，平行鋪 3 板。置于 37 ℃、5% CO2培養箱中，培養期間避免觀察或動板，以免融合細胞移動位置。8 ~ 11 d 后肉眼可見針尖大小白色斑點，顯微鏡下觀察即為細胞克隆團，挑取后直接移種至含飼養細胞的 96 孔板中進行培養。用 ELISA 間接法檢測上清抗體效價，獲取分泌高效價抗體的雜交瘤細胞株[6]。按常規方法制備小鼠雜交瘤細胞腹水，先用辛酸-硫酸銨沉淀法粗提腹水，然后將粗提液經 A 蛋白親和層析柱進行純化[7]。

1.2.2 多抗的制備和純化 用 PBS 緩沖液稀釋白喉、破傷風類毒素抗原至 2 mg/ml，與等體積的弗氏完全佐劑乳化后，經皮下多點注射 12 周齡、體重 2.5 ~ 3 kg 的雌性家兔，每組抗原免疫 2 只家兔，1 mg/只，以后每隔 2 周以抗原加弗氏不完全佐劑經皮下進行加強免疫，加強免疫 4 次，于最后一次免疫一周后，耳部靜脈取血，分離血清。用 ELISA 間接法檢測每份血清抗體效價，每組選取抗體效價高的家兔血清用辛酸-硫酸銨沉淀法進行純化。

1.2.3 夾心 ELISA 法的建立

1.2.3.1 標準曲線的繪制 應用方陣滴定法分別確定白喉和破傷風包被單抗、檢測多抗的最佳工作濃度，酶標二抗的工作濃度為 1:60 000。將包被抗體用 pH 9.6 碳酸鹽緩沖液稀釋至確定的包被濃度，以 100 μl/孔包被 ELISA 板，4 ℃ 過夜。用 0.5% BSA 封閉，37 ℃ 1 h 后，洗滌。然后加入

等體積一系列不同濃度的抗原標準品（白喉為 0 ~ 0.4 Lf/ml，破傷風為 0 ~ 0.4 Lf/ml），每個濃度均作復孔，100 μl/孔，用于確定兩種抗原檢測方法的檢測線性范圍。37 ℃ 1 h 后洗滌。按確定的濃度加入檢測多抗，100 μl/孔，37 ℃ 1 h 后洗滌。按工作濃度（1:60 000）加入檢測酶標二抗，100 μl/孔，37 ℃ 1 h 后洗滌。加 OPD 底物顯色，終止反應，用酶標儀測定 490 nm 下的吸光度（）。以抗原標準品不同濃度為橫坐標，其相應的吸光度值為縱坐標，進行四參數擬合繪制標準曲線。

1.2.3.2 方法學驗證 對供試品和標準品的劑量反應曲線同時進行擬合，以平行線法定量檢測白喉類毒素和破傷風類毒素抗原含量。①特異性：用建立的 ELISA 方法檢測白喉類毒素、破傷風類毒素、百日咳毒素、絲狀血凝素、黏附素，分別評價兩種方法的特異性。②定量限：以白喉抗原國際標準品0.0015625、0.00078、0.00039、0.000195 Lf/ml 四個稀釋濃度的樣品作為待測樣品，0.05 Lf/ml 稀釋濃度作為標準品；破傷風抗原國家標準品 0.00625、0.003125、0.0015625、0.00078 Lf/ml 四個稀釋濃度的樣品作為待測樣品，0.1 Lf/ml 稀釋濃度作為標準品，依次加入已包被抗體的酶標板 A 排中，待測樣品和標準品同時進行 2 倍系列稀釋至第八孔，應用已建立的 ELISA 方法，分別測定各樣品抗原含量，每個樣品重復測定 6 次。計算每個樣品測定結果與理論值的偏差，以確定檢測方法的定量限。③準確度：在零濃度標準溶液中，分別添加已知的白喉類毒素標準品 0.01 Lf/ml 和破傷風類毒素 0.02 Lf/ml，再進行 ELISA 檢測，并計算含量，根據公式：回收率（%）= 測得值/ 真實值 × 100% 得出準確度。④精密度：選取高、低濃度的白喉抗原標準溶液（0.025 Lf/ml，0.00625 Lf/ml）和破傷風抗原標準溶液（0.05 Lf/ml，0.0125 Lf/ml），每份標準溶液同批測定 10 次，重復試驗 3 次，計算測定結果的平均值和標準差，得出批內變異系數（CV）和批間 CV，評價方法的精密度。

2 結果

2.1 最佳工作濃度的確定

方陣滴定法結果顯示，采用白喉單抗 D09A07 和破傷風單抗 T3C10 作為包被抗體時的標準曲線有較大的斜率，并確定了兩種抗原 ELISA 檢測方法中包被單抗、檢測多抗的最佳工作濃度分別為 3 μg/ml 和 1 μg/ml。

2.2 標準曲線的繪制

以類毒素抗原標準溶液濃度（白喉為 0 ~0.05 Lf/ml；破傷風為 0 ~ 0.1 Lf/ml）為橫坐標，其相應的值為縱坐標，進行四參數擬合，繪制標準曲線，結果見圖 1 和圖 2。檢測白喉類毒素和破傷風類毒素抗原的 ELISA 方法標準曲線四參數方程分別為 Y =（–0.012 – 1.796）/[1 +（x / 0.004）?0.862]+ 1.796，相關系數2為 0.999；Y =（0.104 – 1.735）/[1 +（x / 0.022）?1.177]+ 1.735，相關系數2為 0.993。結果證實白喉類毒素和破傷風類毒素抗原濃度與相應值在檢測范圍內有良好的線性關系，表明了兩種 ELISA 檢測方法的可靠性。

圖 1 白喉類毒素 ELISA 檢測方法的標準曲線

Figure 1 Standard curve of diphtheria toxoid by ELISA assay

圖 2 破傷風類毒素 ELISA 檢測方法的標準曲線

Figure 2 Standard curve of tetanus toxoid by ELISA assay

2.3 方法學驗證

2.3.1 特異性 用建立的 ELISA 方法檢測白喉類毒素、破傷風類毒素、百日咳毒素、絲狀血凝素、黏附素，結果表明白喉抗原 ELISA 檢測方法除了與白喉類毒素反應，對其他四種物質均無交叉反應；破傷風抗原 ELISA 檢測方法除了與破傷風類毒素反應，對其他四種物質均無交叉反應。

2.3.2 定量限 測定不同濃度的白喉類毒素國際標準品和破傷風類毒素國際標準品，根據檢測結果與理論值偏差≤ 20% 的最低稀釋濃度來確定方法的定量限。當白喉類毒素標準品稀釋至 7.81 × 10-4Lf/ml 時檢測偏差為 13.90%，稀釋至 3.91 × 10-4Lf/ml 時檢測偏差> 20%，因此檢測白喉類毒素抗原的定量限為 8.90 × 10-4Lf/ml。當破傷風類毒素標準品稀釋至 3.13 × 10-3Lf/ml 時檢測偏差為 7.56%，稀釋至 1.56 × 10-3Lf/ml 時檢測偏差> 20%，因此檢測破傷風類毒素抗原的定量限為 2.13 × 10-3Lf/ml（表 1 和表 2）。

2.3.3 準確度 回收試驗結果顯示檢測白喉類毒素和破傷風類毒素兩種 ELISA 檢測方法的回收率分別為 98.35% 和 107.28%，符合規定。

2.3.4 精密度 試驗結果顯示，白喉類毒素的 ELISA 檢測方法在高濃度時，平均批內 CV 和批間 CV 分別為 8.74% 和 9.68%，低濃度時平均批內CV 和批間 CV 分別為 10.59% 和 13.51%；破傷風類毒素的 ELISA 檢測方法在高濃度時平均批內CV 和批間 CV 分別為 12.35% 和 5.24%，低濃度時平均批內 CV 和批間 CV 分別為 13.96% 和 10.06%，符合規定。

表 1 白喉類毒素 ELISA 檢測方法的定量限驗證結果

表 2 破傷風類毒素 ELISA 檢測方法的定量限驗證結果

3 討論

白喉是一種由白喉棒狀桿菌引起的急性上呼吸道傳染病，人群對白喉普遍易感，以兒童為多。破傷風是由破傷風梭狀芽孢桿菌感染引起的嚴重感染性疾病，目前在大部分發展中國家仍然是一個主要的公共衛生問題，世界范圍內每年死于破傷風的人群 80% 為新生兒[1-2]。預防白喉和破傷風最有效的手段是對嬰幼兒和高危人群實施疫苗的免疫接種。目前國內外使用的白喉和破傷風疫苗均為細菌產生的外毒素經精制、甲醛脫毒后制成的類毒素疫苗。不具有外毒素的毒性，但保留了其免疫原性，能刺激機體免疫系統產生特異的保護性抗體，通過對人群的廣泛接種可有效降低疾病的發病率和死亡率。

有效抗原的含量測定是疫苗質量控制的重要指標。目前白喉和破傷風類毒素疫苗的抗原含量檢測方法是利用類毒素與相應抗毒素在適當的含量、比例、溫度、反應時間等條件下，發生抗原抗體結合，產生肉眼可見的絮狀凝集反應的原理進行，以絮狀單位表示，該方法操作需要經驗豐富的技術人員完成，終點判斷存在一定人員誤差。

本研究利用抗白喉、破傷風單克隆抗體作為包被抗體，兔抗白喉、破傷風多抗作為二抗，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 IgG 抗體作為酶標抗體，建立了定量檢測白喉和破傷風類毒素含量的夾心 ELISA 方法，方法學驗證結果顯示，這兩種 ELISA方法的特異性強、準確性高、重復性好，方法操作 簡單，易于推廣，可廣泛用于白喉破傷風疫苗的質量控制和生產過程控制，包括鑒別試驗、抗原含量測定、吸附度測定等疫苗質控關鍵項目，對提高我國白喉和破傷風類毒素疫苗的質量有重要的實際意義。

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Establishment of ELISA assays for determination of the diphtheria toxoid and tetanus toxoid

TAN Ya-jun, XIA De-ju, LI Zhe, CHAO Zhe, TIAN Lin, DONG Guo-xia, HOU Qi-ming, MA Xiao

Key Laboratory of the Ministry of Health for Research on Quality and Standardization of Biotech Products, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China

This study aims to establish two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) methods for quantitative determination of the diphtheria toxoid (DT) and tetanus toxoid (TT), respectively.

The assay system was based on the sandwiching of the antigen between a monoclonal mouse anti-DT or anti-TT antibody pre-coated on a 96-well polystyrene plate, and a polyclone rabbit anti-DT or anti-TT antibody, which was then detected with a peroxidase-labeled goat anti-rabbit antibody. Then the two ELISA assays with parallel lines were validated.

Validation results of the two quantitative ELISA methods were in accordance with the regulations. The limit of quantity of ELISA method for quantitative detection of DT was demonstrated to be 8.90 × 10-4Lf/ml, and its average recovery rate was 98.35%. The intra-assay coefficient of variation (CV) and inter-assay CV of this DT assay were less than or equal to 10.59%, and 13.51%,respectively. The limit of quantity of ELISA method for quantitative detection of TT was also demonstrated to be 2.13 × 10-3Lf/ml, and its average recovery rate was 107.28%. The intra-assay CV and inter-assay CV of this TT assay were less than or equal to 13.96% and 10.06%, respectively.

The two ELISA methods for quantitative determination of the diphtheria toxoid and tetanus toxoid are specific, accurate and reproducible, which may be used for the quality control of diphtheria and tetanus vaccines and production process control.

Diphtheria; Tetanus; Antigen; Diphtheria-tetanus vaccine; Enzyme-linked immunosorbent assay

MA Xiao, Email: maxiao421@sina.cn; XIA De-ju, Email: xiaju2007@126.com

“十三五”國家科技重大專項（2018ZX09738005）

馬霄，Email：maxiao421@sina.cn；夏德菊，Email：xiaju2007@126.com

2018-06-29

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.06.002