重組纖溶酶抑制劑Textilinin-1蛋白含量測定方法的對比研究

蘭海英，康樂，陳宏超，李娜，徐梅

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重組纖溶酶抑制劑Textilinin-1蛋白含量測定方法的對比研究

蘭海英，康樂，陳宏超，李娜，徐梅

110171 沈陽，遼寧遠大諾康生物制藥有限公司

Textilinin-1 是從擬眼鏡蛇中提取的 Kunitz 型蛋白酶抑制劑，具有纖溶酶抑制活性，可抑制基于纖溶酶被激活導致纖維蛋白溶解所導致的出血，因此具有開發為止血藥的潛力，可以作為外科手術中抑肽酶的替代藥物[1]。目前已有含 Textilinin-1 基因的重組畢赤酵母菌種，能高效表達目的蛋白[2]。

蛋白質含量測定是重組蛋白類藥物質量控制中的重要指標之一，準確的蛋白質含量測定對產品的分裝、比活性計算、殘留雜質的限量控制以及其他理化特性測定均具有重要意義[3]。在研究過程中，我們發現不同方法測定的 Textilinin-1 蛋白含量結果差異很大，表明結果的準確與使用的方法有相關性。為了提高產品質量指標的準確性以及未來生產中的工作效率，我們比較分析了凱氏定氮法、BCA 法和紫外吸收法在 Textilinin-1 蛋白含量測定中的精確性和準確性，結果表明紫外吸收法是更適合于測定 Textilinin-1 蛋白含量的質量控制方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品 中試生產的 3 個批次的 Textilinin-1 蛋白原液 20160804、20160810 和 20160819；對照品牛血清白蛋白（BSA）購自美國 Sigma 公司，批號 WXBC3531V。

1.1.2 主要試劑及儀器 BCA 蛋白質定量檢測試劑盒購自生工生物工程（上海）公司；鹽酸標準滴定液購自沈陽化學試劑廠；催化劑片購自丹麥福斯公司；濃硫酸、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）等試劑均為國產分析純；KjeltecTM8400 凱氏定氮儀和 TecatorTMDigestor 消化爐購自丹麥福斯公司；Biotek Epoch2 多功能酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司；UV5Bio 紫外分光光度計購自美國梅特勒公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品 50 mmol/L 的 Tris-HCl（pH 7.5）為空白對照；供試品為 3 批次 Textilinin-1 蛋白原液；BSA 用空白對照液溶解配成 40 mg/ml 的溶液作為對照品。

1.2.2 凱氏定氮法 按照 KjeltecTM8400 自動定氮儀使用操作規程對樣品定氮。上述樣品分別準確量取 2 ml 加入消化管，同時加入一片催化劑片及 10 ml 濃硫酸，置消化爐上，采取逐步升高溫度的方法 250 ℃ 30 min，330 ℃50 min，420 ℃ 2 h 進行消化后冷卻至室溫。將樣品置于凱氏定氮儀上定氮，供試品和對照品測定結果分別除以各自蛋白的氮含量系數 15.90%（Textilinin-1）和 16.45%（BSA 蛋白），即得到供試品和對照品的蛋白質含量。供試品和對照品都平行測定 3 次。

1.2.3 BCA 法 按照 BCA 蛋白質定量檢測試劑盒的說明書進行操作。562 nm 檢測波長下，采用酶標板法在酶標儀中進行測定，3 批次供試品的檢測值應該落在標準曲線范圍內，最終的稀釋倍數為 20160804 稀釋 400 倍，20160810 稀釋 240 倍，20160819 稀釋 504 倍，對照品稀釋 100 倍，所有檢測樣品均進行 3 個平行稀釋。根據標準曲線，得到稀釋樣品的蛋白濃度，再乘以稀釋倍數得到樣品濃度。

1.2.4 紫外吸收法 將 3 批次供試品 20160804 稀釋 100 倍，20160810 稀釋 60 倍，20160819 稀釋 126 倍，對照品稀釋 40 倍，所有檢測樣品均進行 3 個平行稀釋。用 1.0 cm 光程的石英比色皿進行檢測。在全波長掃描模式下進行掃描，得到 Textilinin-1 蛋白和 BSA 蛋白的最大吸收波長（277 nm 和 278 nm）。在各自的最大吸收波長下，確保吸光值（）在 0.3 ~ 0.7 之間。根據朗伯-比爾定律C =（/ ε）× 10 求得蛋白濃度。ε 為蛋白的百分比消光系數。Textilinin-1 蛋白的 ε 經本實驗室前期工作確證為 7.3，BSA 蛋白的 ε 為 6.6[4]。

2 結果

2.1 BCA 法的標準曲線

以試劑盒中的 BSA 標準品濃度為橫坐標，以其各濃度在 562 nm 處吸光值為縱坐標，繪制標準曲線（圖 1）。得到回歸方程 y = 0.952x + 0.121，線性相關系數2= 0.997，表明線性關系良好。

圖 1 BCA 法標準曲線圖

2.2 3 種檢測方法對蛋白含量測定結果比較

3 種檢測方法對蛋白含量測定結果見表 1。

由表 1 結果可以看出，3 個平行檢測值的變異系數均 < 5%，說明實驗操作過程誤差小，實驗結果可靠。對照品 BSA 溶液的 3 種檢測方法的蛋白含量結果接近一致，而3 批原液的檢測結果，凱氏定氮法與紫外吸收法檢測結果接近，BCA 法則比其他兩種方法檢測值高出 50% 以上，詳細的比較結果見表 2。

對供試品 Textilinin-1 蛋白與標準品 BSA 蛋白的還原性氨基酸數量進行比較分析，結果見表 3。Textilinin-1 蛋白中含有的還原性氨基酸比例為 15.25%，BSA 蛋白的比例為 9.78%。

3 討論

曲耀成和姚雪[5]將蛋白含量測定方法系統地分成 3 類：標準定量法（包括凱氏定氮法和氨基酸分析法）、比色分析法（包括 Lowry 法、雙縮脲法、BCA 法和 Bradford 法）以及紫外吸收法。本實驗采取的 3 種檢測分屬于此 3 類方法。

凱氏定氮法是一種通過含氮量分析進行蛋白質含量測定的經典方法，其優點是定量準確，重現性好，被國際國內作為法定的標準檢驗方法。其缺點是操作復雜費時，試劑消耗量大。本實驗對樣品進行的凱氏定氮測定結果可以作為標準定量，以尋找更簡便、快速、準確的方法。

表 1 3 種蛋白含量測定方法的測定結果

表 2 3 種檢測方法的蛋白含量差異率的比較

表 3 Textilinin-1 蛋白和 BSA 蛋白中還原性氨基酸數量的比較

BCA 法反應原理為蛋白質將二價銅離子還原成亞銅離子，后者在堿性條件下與 BCA 絡合生成紫紅色絡合物。此化合物在 562 nm 處有最大吸收波峰，反應物的顏色和蛋白濃度在一定范圍內具有線性關系。BCA 法反應原理包括兩個方面：一是蛋白中的肽鍵將 Cu2+還原為 Cu+，并且在60 ℃條件下，肽鍵將 Cu2+還原為 Cu+的作用比在室溫更大；二是蛋白中的色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、半胱氨酸（Cys）等還原性氨基酸將 Cu2+還原為 Cu+，這一反應與溫度關系不大[6]。本研究中，3 批原液的 BCA 法檢測值均高于凱氏定氮法檢測值的 50% 以上，說明 BCA 法中使用的標準品 BSA 蛋白不能準確地定量供試品蛋白，其原因是兩種蛋白之間的差異性較大，這些差異可能與蛋白質的氨基酸序列、等電點、蛋白質結構以及能夠引起蛋白顏色反應產生顯著變化的側鏈或輔基等有關[7]。表 3 中供試品蛋白含有的還原性氨基酸比例為 15.25%，而標準品 BSA 蛋白的比例僅為 9.78%。因此， BCA 法檢測供試品蛋白含量偏高的主要原因可能是因為供試品中還原性氨基酸含量比標準品 BSA 中還原性氨基酸含量高 50% 以上，從而增加了 Cu2+還原為 Cu+的數量，因此 Cu+與 BCA 絡合生成紫紅色絡合物的產物就增加了，相應的檢測值就高。

比色分析法中的其他方法的蛋白含量測定原理和 BCA 法相似，因此，通過BCA 法實驗結果可以得到如下提示：在采用比色分析法之前，可以先對待測樣品與標準品的氨基酸序列進行比較，如果待測樣品的還原性氨基酸的含量與標準品相差較大時，就不適宜采用比色分析法進行測定。如果想要采用比色分析法定量，只有采用與待測樣品相同的蛋白質作為標準品，才能有效避免實驗誤差。

紫外吸收法的原理是由于色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸結構中的苯環含有共軛雙鍵，因此賦予了蛋白質在 280 nm 處的紫外吸收特性。根據朗伯-比爾定律，在已知光程和消光系數的前提下，通過測定蛋白樣品在波長 280 nm 的吸收值，即可獲得蛋白含量。本實驗結果表明用紫外吸收法與凱氏定氮法測定供試品蛋白含量差異小于 5%，其結果接近準確值。同時，與其他方法相比較，紫外吸收法還具有操作簡單、快速、成本低、無污染的優勢，并且測定后樣品還可以回收使用。本方法的核心問題就是消光系數的確定，一般來說，通過基因重組技術獲得的蛋白質藥物，其序列信息已知，可以通過 Edelhoch 公式即 ε280=（5500 × nTrp）+（1490 × nTyr）+（125 × n S-S）計算蛋白的理論摩爾消光系數[8]。同時，在一般情況下獲得的重組蛋白的純度較高，通過凱氏定氮法準確定量蛋白質量，通過朗伯-比爾定律計算得到實測消光系數，并與理論消光系數對比，可以進一步確證消光系數，這樣就能保證紫外吸收法測定蛋白含量的準確性。本實驗的供試品蛋白為含有 59 個氨基酸的蛋白質，根據其 Trp、Tyr 及形成二硫鍵的數量，得到的理論摩爾消光系數為 4845，再除以蛋白分子量，得到理論百分比消光系數為 7.2。凱氏定氮法定量的供試品蛋白溶液測定 277 nm 下的紫外吸收值，通過公式計算得到實測的百分比消光系數為 7.3，與理論值相差為 1.4%，考慮到蛋白質在自然狀態下的空間結構也許會對消光系數產生影響，因此采用實測百分比消光系數值 7.3。不同的蛋白可能會存在理論值與實測值差異較大的情況，因此，在對消光系數賦值時，都需要進行確證，以保證后續工作的準確性。目前，已有多種重組蛋白和抗體采用紫外吸收法進行蛋白含量的測定[9-11]。

通過對本研究結果進行比較分析，紫外吸收法具有準確、操作簡單、快速的優勢，因此確定紫外吸收法用于重組纖溶酶抑制劑 Textilinin-1 的蛋白含量測定。

通過對 3 類蛋白質定量檢測方法的研究進行如下總結：對于還未獲得蛋白標準品的情況下，可以先采用標準定量法（凱氏定氮法或氨基酸分析法）進行標準蛋白的標定及消光系數的測定，并與理論消光系數對比確證。當得到標準蛋白后，蛋白含量的測定可以采用比色分析法；當確證消光系數后，可以采用紫外吸收法。在實際工作中，對于一個全新的蛋白藥物，在選擇和確定檢測方法時，尤其是涉及建立質量標準的研究，都需要根據目標蛋白的屬性選擇不同原理的方法、不同廠家的試劑進行系統分析和對比研究，最終確定合適的測定方法，保證實驗結果的科學性和準確性。

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徐梅，Email：xumei@nkbp.com

2018-05-31

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.06.015