一對雙胞胎腦癱患兒全基因組測序分析

朱慶文，周 翔，倪玉飛，王 婧，印洪剛，張 勤，卞文君，張玲莉，林孟思，劉江悅，周 君，沙春秀

南通市婦幼保健院(南通大學附屬婦幼保健院)產前診斷中心 江蘇南通 226006

腦癱是目前導致我國兒童致殘的首位原因[1]。臨床上誘發腦癱的因素很多。由于腦癱患兒擁有近似的癥狀，故遺傳因素成為腦癱病因探索的重要方向。已有大量文獻[2-3]報道了拷貝數變異(copy number variation, CNV)、腦癱的易感基因，以及數量較少的家族性遺傳性腦癱的單基因突變的研究。全基因組測序(whole genome sequencing,WGS)技術可以進行CNV、易感基因、單基因突變等分子生物學分析，是很好的疾病遺傳學病因分析工具。我們對一對胞胎腦癱患兒進行了WGS分析，測序數據比對參考了人類參考基因組(version: NCBI Build37/hg19)。現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料雙胞胎腦癱患兒來自于當地，于2016年2月來我院進行兒童康復訓練，屬于異卵雙胞胎，均為男性，年齡2歲。臨床癥狀：兩例患兒發育遲緩，運動功能不協調，智商落后于正常同齡兒童，存在認知與言語障礙。參照2014年中華實用兒科臨床雜志制定的腦性癱瘓的定義、診斷條件和分型標準[4]，兩例被臨床分型為混合型和肌張力低下型腦癱?；旌闲湍X癱患兒MR影像可見：兩側腦室及第三腦室擴張，兩側額顳部顱板下見弧形液性信號影；胼胝體偏薄，腦溝腦池正常，腦中線結構居中，右側乳突氣房內見高信號。肌張力低下型患兒MR影像可見：雙側側腦室周圍見少許斑片狀長T1長T2異常信號，腦白質少，胼胝體較薄，兩側腦室擴張，形態欠規則，腦中線結構居中。

患兒父母查體未見異常，常見遺傳代謝性疾病如苯丙酮尿癥、糖或氨基酸代謝異常等疾病的篩查試驗均正常，否認產傷史，否認病毒、細菌感染用藥史，否認毒物、放射性物質、寵物接觸史，否認糖尿病等病史。本研究獲患兒家屬知情并簽署知情同意書。

1.2WGS檢測方法和數據分析委托藥明康德公司對兩例患兒樣本進行雙端150 bpWGS檢測(Hiseq X Ten測序儀，美國Illumina公司)。生物信息學分析由蘇州貝康生物公司協助完成，遺傳學分析由本科室生物信息以及遺傳分析人員進行。雙胞胎父母CNV驗證試驗采用基因芯片法，由本科室實驗人員采用昂飛750K芯片進行檢測。

2 結果

2.1數據質量評估Hiseq X Ten平臺測序數據有效利用率大于90%，Q30≥80%，說明堿基質量穩定，能夠保證后續分析的正常進行。測序數據堿基分布評估結果顯示，不存在AT、 GC分離現象，測序數據符合實驗要求。2例標本的測序深度主要集中于20X(85.89%和82.49%)；除Y染色體覆蓋度較低外，大多數染色體覆蓋度在90%以上。各條染色體上的測序深度以及覆蓋度見圖1。

2.2變異檢測結果SNP、InDel和CNV檢測結果

見表1～3。對檢測到的SNP和INDEL進行如下過濾：去除人群數據庫中突變頻率過高(AF>0.05)的變異，去除ClinVar數據庫注釋為良性或疑似良性的變異，去除突變堿基深度過低(AO<5)的變異，去除位于內含子和基因間區的變異，去除同義突變，去除本地外顯子數據庫中突變頻率過高(AF>0.05)的變異。對所有共有突變進行腦癱相關基因的篩選，主要與Genetics Home Reference數據庫比對，共檢索到與兩例相關的30個基因(表4)。共有7個基因(CD59、FOLR1、 KANK1、MEF2C、PRKCH、ROBO3、SLC25A12)為兩例患兒共有突變(表5)。在7個基因中，只在KANK1的外顯子區域發現了一個兩例共有的突變： NM_153186:c.1517C>T，是錯義突變。經數據庫檢索及分析，我們認為該突變致病的可能性相對較小，屬于臨床意義不明的變異位點。

2.3患兒父母CNV驗證結果對患兒父母進行基因芯片檢測，結果(圖2)顯示：患兒母親在14號染色體同樣有一個缺失，大約543 kb，涉及TRA和TRD兩個基因；兩個患兒該突變應是遺傳母方；查詢NCBI、Genetics Home Reference、OMIM數據庫，TRA和TRD屬于蛋白質編碼基因，與T細胞受體α/β缺乏等疾病相關聯，與腦癱關聯不大?；純?號染色體存在120 kb重復,父母雙方此重復均較小(未達到芯片檢測重復>500 kb的標準)，同時該片段上的基因LINC01813屬于ncRNA，與腦癱關聯亦不大。

表1 外顯子區域中不同類型SNP數目

表2 外顯子區域不同類型InDel數目

表3 共有的CNV檢測結果

表4 30個與病例相關的腦癱基因

表5 位于已知腦癱相關基因上的共有突變

A：父親；B：母親

3 討論

在大量腦癱原因分析的文獻中，由于著重點集中在CNV、易感基因的檢測、家族性遺傳性腦癱的單基因突變的致病基因等單項研究上[2-3]，對患兒其他遺傳因素的篩選，難免有遺漏的可能性存在。兩例腦癱患兒都具有積水表現，臨床分型分別為混合型和肌張力低下型，臨床癥狀有輕重之別。雙胞胎患兒遺傳背景相似，發生腦癱的外部因素近似，由此通過WGS分析找到腦癱發生的共同的遺傳因素的概率較大，對這些共同的遺傳因素擴大病例篩選，有可能獲得腦癱發生的遺傳標志物。在本研究中，我們首先排除了一些有與腦癱相近似癥狀的罕見遺傳病，如罕見神經系統肌肉疾病(佩梅病、肌張力障礙及其相關基因的疾病等)、代謝紊亂相關疾病(嘌呤/嘧啶代謝異常、丙酮酸脫氫酶缺乏癥、血漿肌酸和胍乙酸異常、3-羥基丁酸酯缺乏、葡萄糖轉運子1缺乏等綜合征)、Cockayne綜合征等罕見的常染色體隱性遺傳疾病[5-9]。同時對CNV、SNP、InDel等變異進行了全基因組的檢測，并不局限于單個基因突變以及部分易感基因的檢測。

WGS獲得的數據量巨大，變異數據也是海量的。經詳細分析比對，本研究共發現30個與腦癱有關聯的基因，如人類轉錄激活因子蛋白4(adaptor protein complex-4, AP4)、GAD1、ADD3等；在KANK1的外顯子區域發現一個共有SNP突變(NM_153186:c.1517C>T)，為錯義突變；CNV分析中，chr2上有大約120 kb的重復，chr14上有大約280 kb和540 kb的缺失，基因芯片驗證試驗證實，該缺失來自于母親。兩個患兒有7個共有的涉及腦癱的基因突變；即使是雙胞胎，也有23個腦癱關聯基因是并不為兩個患兒所共有，涉及胎兒腦部生長發育、遺傳性腦癱、智障血栓等基因；說明兩例患兒腦癱發生機制可能并不相同，造成兩例患兒的遺傳表型特征不一致，這可能是兩例患兒臨床特征不一致的原因。上述發現也說明，雖然一些胎兒在腦癱前未發生缺氧缺血事件，但出生后仍發生腦癱，表現出更易發病的傾向[10]，有其遺傳基礎。

AP4屬于已知的遺傳性腦癱高發相關基因，包含4個亞基，AP4B1、AP4S1、AP4M1 和AP4E1，其中任何一個亞基異常都會導致AP4 復合物的功能障礙，可能會導致兒童腦癱的發生[11]。同時AP4 介導轉運的蛋白質分子AMPA一旦受到影響，AMPA受體介導的谷氨酸興奮性毒性會參與缺氧缺血性腦白質損傷的發生[12]。在中國漢族人群中，AP4B1 與伴有缺血缺氧性腦病腦癱患兒的關系最為密切[13]。GAD1 基因突變會影響腦脊液中谷氨酸與GABA 濃度失衡，從而影響腦細胞的發育[14]。ADD3 基因編碼內收蛋白的γ亞基，其與α、β等亞基構成的異源二聚體或異源四聚體與肌動蛋白、血影蛋白復合體結合，可以影響骨架蛋白的穩定性，導致成纖維母細胞異常分化和移行，進而發生腦癱[15-16]。7個共有腦癱相關基因突變中, KANK1是惟一的外顯子區域的突變。查詢 OMIM、NCBI數據庫(CPSQ2; 612900)、(OMIM: 607704)，只能檢索到一個與KANK1外顯子區域突變有關的記錄，且記錄的突變類型為缺失，不是點突變；在其他相關數據庫中未檢索到該點突變影響腦癱發生的報道。因此該突變致病的可能性相對較小[17]，按照ACMGD分類原則，可將其定義為臨床意義不明的突變。KANK1 基因編碼的蛋白為細胞骨架相互作用蛋白，可能作用于發育中的大腦[18]。CD59基因與血栓有關，其編碼的CD59蛋白是一種補體調節蛋白，對細胞凋亡、組織損傷造成的局部血管栓塞有重要的調控作用，但作為腦癱高危基因，還很罕見報道。常見文獻報道的血栓易感基因有遺傳性血栓因子V 的Leiden(FV G1691A)、C 或S 蛋白和抗凝血酶Ⅲ、高同型半胱氨酸血癥、亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和凝血酶原基因等[19-20]。但也有文獻[21]報道FV G1691A、MTHFR 和凝血素G20210A 等基因與罹患腦癱無明顯關聯。本研究未發現上述基因異常，因此上述血栓易感基因對腦癱的發生是否有影響還不能完全證實。其他5個共有基因突變與腦癱的關系還需要繼續累積數據，才能從遺傳學上給予判斷。

WGS檢測的視野是全景的，因此，本研究還可以與部分文獻的結論進行對比。有研究[22]認為ApoE 基因中的ApoEε2、ApoEε3 在腦損傷中起保護作用，ApoEε4 與腦癱的嚴重程度密切相關；也有作者[23-24]認為在中國人群中ApoE 基因多態性可能是腦癱發病的一個潛在危險因素，但并沒有發現ApoEε4 與腦癱的相關性。我們未在兩例雙胞胎中檢測到ApoE 基因的異常。一些與東亞人群腦癱相關的易感基因，如骨調素基因(OPN)[25]、Ⅳ型膠原基因A1(COL4A1)[26]、腫瘤壞死因子-腫瘤壞死因子4A1[27]等，也沒有在雙胞胎中檢測到。這些結果也說明，家族性遺傳性腦癱單基因突變檢測在分析腦癱致病遺傳因素方面有明顯的局限性。

在本研究中，我們還檢測到了CNV，分別為2號染色體上大約120 kb的重復，14號染色體上大約280 kb和540 kb的缺失，經與NCBI、Genetics Home Reference、OMIM數據庫的比對，結果顯示：在數據庫中2號染色體上的重復區間均小于500 kb,因此其臨床意義屬于可能良性和意義不明；14號染色體上的缺失的臨床意義不明，其致病可能性不確定。采用基因芯片檢測其父母，并沒有檢測到相關重復，只在母親14號染色體發現了547 kb的缺失，證實該缺失遺傳于母親，但重復和缺失包含的基因對腦癱遺傳貢獻不大。有文獻[28]報道了CNV拷貝數變異，但本研究例數較少，比較的意義不大。

綜上所述，我們認為腦癱的致病因素表現出復雜的遺傳傾向性，腦癱可能是由多個基因誘發的，易感基因檢測、遺傳性腦癱的單基因突變研究仍然是腦癱致病因素探索的主要方向。