葛根素對多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖和凋亡的影響

王樂峰,周 華,劉魯昱

1)新汶礦業(yè)集團中心醫(yī)院骨二科 山東泰安 271200 2)山東大學附屬省立醫(yī)院血管外科 濟南 250021 3)山東省立第三醫(yī)院急診科 濟南 250000

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是骨髓漿細胞異常增殖的造血系統(tǒng)惡性腫瘤。近年來，其發(fā)病率有逐漸上升的趨勢[1]。葛根素是一種從中草藥葛根中提取的異黃酮，具有鎮(zhèn)靜、退熱和增加冠狀動脈血流量等功能，臨床上多用于高血壓和冠心病等心血管疾病的治療[2]。大量研究[3-4]數(shù)據(jù)顯示，葛根素有抑制白血病、胃癌和肺癌等多種腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡的作用。本研究通過觀察葛根素處理后體外培養(yǎng)的MM H929細胞增殖及凋亡情況的變化，以期為MM的治療提供新的線索和方向。

1 材料與方法

1.1細胞、試劑和儀器H929購自美國ATCC公司，葛根素和RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Sigma公司，青鏈霉素雙抗、胰蛋白酶和CCK-8試劑均購自太原來寶生物公司，胎牛血清購于杭州四季青公司；AKT抗體、p-AKT抗體、Bcl-2抗體、Cleaved Caspase-3抗體、GAPDH抗體及辣根過氧化酶(HRP)標記的二抗均購于美國Abcam公司。總蛋白提取試劑盒、Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒均購于南京凱特生物公司，流式細胞儀為Becton Dickinson公司產(chǎn)品，酶標儀和CO2培養(yǎng)箱為Thermo公司產(chǎn)品。

1.2細胞培養(yǎng)將解凍復蘇后的H929細胞接種到已提前加入體積分數(shù)為10%胎牛血清和100 U/mL的青鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于飽和濕度、體積分數(shù)5% CO2和37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細胞貼壁情況，當細胞占培養(yǎng)瓶80%左右時，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化，按照1∶2比例進行傳代培養(yǎng)。

1.3CCK-8法檢測細胞的增殖情況收集生長狀況良好的對數(shù)生長期H929細胞，按照3×105個/mL密度接種到96孔培養(yǎng)板上，分別用0、20、40和80 μmol/L葛根素處理，其中以0 μmol/L葛根素處理為對照，每組設置3個復孔；在CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h后，每孔加入CCK-8溶液 10 μL 繼續(xù)培養(yǎng)2 h，以酶標儀檢測各孔在490 nm處的光密度(OD)值。

1.4AnnexinV-FITC和PI雙染法檢測細胞的凋亡情況收集1.3中經(jīng)葛根素作用48 h后的細胞，每組細胞設置3個重復，根據(jù)凋亡檢測試劑盒說明分別加入Annexin V-FITC和PI溶液進行雙染色，避光反應10 min后，上流式細胞儀檢測凋亡率。

1.5Westernblot檢測細胞中AKT、p-AKT、Bcl-2和CleavedCaspase-3蛋白的表達收集1.3中經(jīng)葛根素作用48 h后的細胞，分別以總蛋白提取試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒提取和定量總蛋白；向所得到的蛋白中加入Loading buffer混勻后，沸水浴變性5 min。取變性蛋白80 μg，以GADPH為內(nèi)參，在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳分離。轉(zhuǎn)膜后，封閉液處理2 h，分別加入一抗(AKT、p-AKT、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3和GAPDH抗體，均稀釋1 000倍)低溫反應過夜。次日，洗膜后加入二抗反應2 h，接著加入ECL化學發(fā)光劑顯影，采集圖像，使用Image J軟件分析條帶，以目的條帶與GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.6統(tǒng)計學處理應用SPSS 20.0分析，各組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較使用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組H929細胞增殖和凋亡率的比較結(jié)果見表1。

表1 4組H929細胞增殖情況和凋亡率的比較

*：組間兩兩比較,P均<0.05

2.2 4組H929細胞中AKT、p-AKT、Cleaved-Caspase-3和Bcl-2蛋白表達的比較結(jié)果見圖1和表2。

1、2、3、4：分別為0、20、40、80 μmol/L葛根素處理組

c(葛根素)/(μmol/L)nAKT p-AKT* Bcl-2* Cleaved Caspase-3*030.75±0.030.56±0.031.58±0.260.09±0.022030.68±0.060.48±0.021.12±0.180.25±0.034030.71±0.050.43±0.050.87±0.050.36±0.058030.70±0.080.32±0.030.45±0.030.55±0.06F0.776 25.766 25.923 60.581 P0.539 <0.001 <0.001 <0.001

*：組間兩兩比較,P均<0.05

3 討論

MM是一種發(fā)病緩慢的漿細胞疾病，目前臨床上以全身化療為主要治療方法，但往往由于患者體質(zhì)的不同，易產(chǎn)生惡心、嘔吐和脫發(fā)等副作用。葛根素作為一種天然中草藥成分，具有安全、來源廣泛等優(yōu)勢。近年來的報道顯示，葛根素可通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。Yang等[5]認為，葛根素能夠抑制膠質(zhì)母細胞瘤U251和U87細胞增殖，誘導細胞凋亡，降低G1期細胞比例和增加S和G2/M期細胞比例。劉建軍等[6]發(fā)現(xiàn)，葛根素通過抑制PI3K/AKT/p53信號通路，抑制骨肉瘤MG63細胞增殖和誘導凋亡。Gan等[7]指出，葛根素能夠誘導細胞生長停滯和凋亡，其作用機制可能與NF-κB信號通路有關。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)葛根素能夠濃度依賴性地抑制H929細胞增殖和誘導凋亡。

PI3K/AKT信號通路是由磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)及其下游分子絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 B (PKB/Akt)組成的信號轉(zhuǎn)導通路，PI3K通過與其上游分子作用，引起PI3K構象的改變，從而磷酸化激活AKT，而活化的AKT通過調(diào)控其下游基因，參與多種腫瘤細胞的增殖、侵襲及凋亡過程[8]。Caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族中的重要凋亡執(zhí)行蛋白，在接受凋亡刺激時，可發(fā)生級聯(lián)反應，誘導細胞凋亡；PI3K/AKT信號通路的激活能夠間接抑制Caspase-3及其下游凋亡靶基因的級聯(lián)反應，進而影響細胞凋亡[9]。Bcl-2是凋亡抑制基因，可與相關的促凋亡蛋白作用，引起細胞凋亡；同時Bcl-2也是PI3K/AKT信號通路下游的重要效應分子[10]。Zhu 等[11]指出，PI3K/AKT信號通路在MM細胞增殖、遷移、血管生成及耐藥性等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。宋斌等[12]研究發(fā)現(xiàn)，MM患者血清中Bcl-2 mRNA表達明顯偏高。PI3K/Akt信號通路、Caspase-3和Bcl-2的異常表達均與MM的發(fā)病和進程密切相關。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葛根素處理后H929細胞中p-AKT和Bcl-2蛋白的表達水平均降低，Cleaved Caspase-3蛋白表達水平升高。以上結(jié)果提示，葛根素可能通過抑制PI3K/AKT信號通路、上調(diào)Cleaved Caspase-3蛋白表達及下調(diào)Bcl-2蛋白表達，抑制H929細胞增殖和促進細胞凋亡。

總之，葛根素能夠抑制MM細胞增殖并誘導細胞凋亡，其作用機制可能與抑制PI3K/AKT信號通路有關。