雞源細菌中5種四環素耐藥基因多重PCR檢測方法的建立

白 龍邵 毅黃柳娟馮 博周昌艷索玉娟白亞龍林 淼

BAI Long1,2 SHAO Yi1,3 HUANG Liu-juan1 FENG Bo1 ZHOU Chang-yan1,3 SUO Yu-juan1 BAI Ya-long1 LIN Miao1

(1. 上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所，上海 201403；2. 上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093；3. 上海市設施園藝技術重點實驗室，上海 201403)

(1. Institute for Agri-Food Standards and Testing Technology, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201403, China; 2. School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China; 3. Shanghai Key Laboratory of Protected Horticultural Technology, Shanghai 201403, China)

四環素(tetracycline，tet)作為一種廣普類抗生素，在禽畜養殖場中被大量使用[1]，導致病原菌產生耐藥性[2]。研究表明，中國肉雞中多種致病菌對四環素類抗生素已經產生了很高的耐藥性[3-5]。因此，禽源四環素耐藥菌的控制迫在眉睫。大量證據[6-8]表明，數量龐大的非致病菌可以是耐藥基因的供體、受體和中間體，因此，近年來，在全細菌范圍內研究抗生素耐藥性的污染特征和耐藥基因的水平遷移規律，成為揭示耐藥性發生機制的新途徑[9]。然而，關于在整個細菌范圍內進行耐藥基因的篩查研究，現有試驗[10-12]大多基于單重或不多于三重的聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)而展開，工作量非常大。因此，亟需開發耐藥基因的快速篩查技術。

細菌對四環素的耐藥機理主要分為主動外排蛋白(涉及的耐藥基因包括tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tetZ、tetJ、tetK、tetL、tetV等)、核糖體保護蛋白(tetM、tetO、tetS、tetW、tetT)、滅活或鈍化四環素酶(tetX、tet34、tet37)[13]。其中tetA、tetD、tetG、tetS和tetX是雞肉中較多檢出的四環素耐藥基因[5]，且涉及了3種四環素耐藥機制。目前，對這5種四環素耐藥菌的多重PCR同時檢測技術尚未見報道。因此，本研究在已有的多重PCR技術開發經驗[14-16]基礎上，通過優化引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度和退火溫度等因素，建立了同時檢測tetA、tetD、tetG、tetS和tetX的五重PCR體系，為禽源四環素耐藥基因的大規模篩查研究提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

四環素耐藥基因tetA、tetD、tetE、tetG、tetL、tetM、tetO、tetR、tetS、tetT和tetX，以及磺胺耐藥基因sul1和sul2片段的陽性克隆：本實驗室克隆構建并保存[17]；

禽源四環素耐藥菌克隆：本實驗室篩查、鑒定并保存[5]；

TakaraExTaq酶：5 U/μL，不含Mg2+，寶日醫生物技術(北京)有限公司；

dNTP Mixture：各2.5 mmol/L，寶日醫生物技術(北京)有限公司；

MgCl2：25 mmol/L，寶日醫生物技術(北京)有限公司；

PCR引物(表1)：10 μmol/L，生工生物工程(上海)股份有限公司；

腦心浸液肉湯培養基(Brain heart infusion broth, BHI)、LB培養基和瓊脂粉：英國 Oxoid公司；

GelStain凝膠電泳染料、2K DNA marker、瓊脂糖、6×DNA Loading Buffer、50×TAE電泳緩沖液、氨芐西林(Ampicillin，Amp)、雙蒸水(dd H2O)： 北京全式金生物技術有限公司；

四環素：美國藥典級，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.2 主要儀器與設備

PCR儀：T100型，美國Bio-Rad公司；

電泳儀：Powerpac Universal型，美國Bio-Rad公司；

凝膠成像分析系統：GelDoc XR+Imager型，美國Bio-Rad公司；

電泳槽：DYCP-31E型，北京六一生物科技有限公司；

微量移液槍：Research Plus型，德國Eppendorf公司；

高速冷凍臺式離心機：Centrifuge 5424 R型，德國Eppendorf公司；

超凈工作臺：SW-CJ-2FD型，蘇州安泰空氣技術有限公司；

搖床：TQ2-312型，上海精宏實驗設備有限公司；

電熱恒溫培養箱：DHG-9203A型，上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 四環素耐藥基因片段陽性克隆DNA模板的制備

根據夏樂先等[21]和劉宗保[22]的方法修改后制備四環素耐藥基因tetA、tetD、tetG、tetS和tetX片段陽性克隆的DNA模板。菌株用含100 μg/mL Amp的LB液體培養基增殖8 h后，取2 mL菌液，12 000 r/min離心3 min，棄去上清液，無菌條件下加入2 mL生理鹽水，振蕩懸浮混合均勻，再用生理鹽水依次10倍梯度稀釋至10-1～10-8，依次取200 μL 稀釋菌液均勻涂布于固體LB培養基上，37 ℃過夜培養，菌落計數并計算對應稀釋液的活菌數，同時，依次取2 mL 稀釋菌液懸浮3 min，沸水浴 10 min后立即冰浴15 min，即得粗提DNA，-20 ℃保存，作為PCR反應的模板。

表1 四環素耐藥基因引物

1.2.2 多重PCR預試驗

(1) 單重PCR靈敏性試驗：以5種四環素耐藥基因片段陽性克隆的粗提DNA為模板，進行單重PCR并用瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，結合稀釋菌液計數結果，初步確定5種耐藥基因的單重PCR靈敏性。

(2) 多重PCR預試驗：根據單重PCR的靈敏性，對5種耐藥基因陽性克隆稀釋菌液分別選擇合適的稀釋濃度下的粗提DNA模板，等比例混合后作為多重PCR的模板，進行多重PCR擴增反應。

(3) 反應體系：混合DNA模板5 μL，Taq酶0.25 μL，每種基因的正向引物和反向引物各1.0 μL，dNTP 4 μL，MgCl24 μL，10×PCR反應緩沖液5 μL，最終用 dd H2O補齊至50 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。以去離子水為模板作陰性對照。瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

1.2.3 多重PCR參數優化

(1) 引物濃度的優化：在預試驗的基礎上，根據各基因PCR擴增產物的長度，按照表2進行引物濃度優化試驗。

(2)Taq酶濃度的優化：在引物濃度優化結果的基礎上優化Taq酶的濃度，在多重PCR反應體系中分別添加0.25(1.25 U)，0.50 (2.50 U)，1.00 (5.00 U)，1.50 μL(7.50 U)Taq酶，考察Taq酶濃度對擴增效果的影響。

(3) 退火溫度的優化：依次選取53，55，57，58 ℃作為退火溫度，進行多重PCR反應體系退火溫度的優化試驗。

表2 多重PCR體系引物濃度的優化

1.2.4 多重PCR的靈敏度和特異性分析 在多重PCR參數優化的基礎上，對混合DNA模板進行10倍梯度稀釋(10-1，10-2，10-3)，考察多重PCR方法的靈敏度。粗提耐藥基因tetA、tetD、tetE、tetG、tetL、tetM、tetO、tetR、tetS、tetT、tetX、sul1和sul2片段陽性克隆菌株的DNA，以優化的反應條件和體系進行PCR，檢測該多重 PCR方法的特異性。

1.2.5 禽源四環素耐藥菌的5種耐藥基因檢測 23株已鑒定四環素耐藥基因攜帶情況的禽源四環素耐藥菌(表3)在含有16 μg/mL四環素的BHI液體培養基活化后粗提DNA，分別用上述優化后的多重PCR體系進行耐藥基因的檢測，驗證方法的實用性。

表3用于驗證多重PCR方法實用性的23株禽源四環素菌

Table3 23 strains of poultry tetracycline resistant bacteria used for verify the utility of multi-PCR system

菌株序號攜帶四環素耐藥基因種屬革蘭氏染色特性1tetABrochothrix thermosphactaG+2tetAStenotrophomonas spG-3tetA、tetSlactic acid bacteriumG+4tetA、tetDSphingobacterium spG-5tetDMacrococcus caseolyticusG+6tetSCarnobacterium spG+7tetXAeromonas spG-8tetA、tetDKurthia spG+9tetA、tetDPseudomonas spG-10tetA、tetDAeromonas spG-11tetA、tetDBrochothrix thermosphactaG+12tetSMacrococcus caseolyticusG+13tetXStaphylococcus spG+14tetSAcinetobacter spG-15tetAPseudomonas spG-16tetSCarnobacterium spG+17tetS、tetXMyroides marinusG-18tetSMacrococcus caseolyticusG+19tetA、tetSCarnobacterium spG+20tetSCarnobacterium spG+21tetSCarnobacterium spG+22tetSCarnobacterium spG+23tetS、tetXSphingobacterium spG-

2 結果與分析

2.1 單重PCR靈敏性試驗結果

用梯度稀釋菌液的粗提DNA作為模板，對5種耐藥基因進行單重PCR擴增(圖1)。選擇比目的條帶可見的稀釋梯度高1～2個梯度的稀釋度，即tetA10-4、tetX10-4、tetG10-3、tetD10-4、tetS10-4，作為多重PCR中混合DNA的模板稀釋度。稀釋菌液的平板計數結果表明，tetA、tetX、tetG、tetD、tetS陽性克隆菌株菌懸液原始濃度為5.1×108，7.6×108，4.3×107，4.5×108，9.2×108CFU/mL，再將各被選中的DNA模板稀釋5.1，7.6，4.3，4.5，9.2倍，制成104CFU/mL的菌液DNA粗提物，等比混合后獲得用于開發多重PCR方法的DNA模板。

在多重PCR體系中，隨著檢測基因位點的增多，即引物數量的增加，每條目的基因的擴增效率會受到影響，某種特異性條帶優先進行PCR反應，而部分條帶甚至無法獲得擴增[23]。在本研究中也出現了類似的情況，當多種DNA模板和引物混合反應后，部分在單重PCR中能夠順利擴增的條帶不再呈現目的條帶。采取階梯增加引物的策略，調整新加入的引物濃度直至獲得擴增，使得PCR體系從一重增加至五重(圖2)。但用該體系和程序對實際細菌樣品進行5種耐藥基因的篩查時，發現部分基因無法擴增，因此需要優化多重PCR的反應體系及反應程序。

圖1 不同稀釋度DNA粗提液的單重PCR擴增結果

Figure 1 The amplification of five tet genes in single PCR with diluent templates

M. 2 K Maker 1. 四環素耐藥基因五重PCR擴增條帶 -. 陰性對照

圖2 多重PCR預試驗擴增結果

Figure 2 Preliminary amplification of multiple PCR

2.2 多重PCR條件優化

2.2.1 引物濃度 當tetA、tetX、tetG、tetD和tetS的引物濃度分別為0.1，0.1，0.2，0.2，0.2 μmol/L(即5對引物的單條引物添加量分別為0.5，0.5，1.0，1.0，1.0 μL，濃度比為1∶1∶2∶2∶2，圖3，泳道3)時，5個目的基因的擴增條帶亮度相近，均能得到比較好的擴增且無非特異性條帶。

2.2.2Taq酶濃度 當多重PCR體系中的Taq酶添加量為1 μL(即Taq酶的終濃度為0.1 U/μL)時，5條目的條帶最為清晰(圖4，泳道3)。

2.2.3 退火溫度 對多重PCR反應的退火溫度進行優化，結果表明，當退火溫度高至58 ℃時(圖5)，部分條帶不再擴增，因此選擇55 ℃作為多重PCR的退火溫度。

綜上，優化后的多重PCR反應體系為：混合DNA模板5 μL，Taq酶1 μL，tetA和tetX的正反向引物各0.5 μL，tetG、tetD和tetS的正反向引物各1.0 μL，dNTP 4 μL，MgCl24 μL，10×PCR反應緩沖液5 μL，最終用 dd H2O補至50 μL。反應程序為：95 ℃ 預變性5 min；95 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。

M. 2 K Maker 1～5.tetA、tetX、tetG、tetD和tetS的引物濃度比分別為1∶1∶1∶1∶2，1∶1∶1∶2∶2，1∶1∶2∶2∶2，1∶2∶2∶2∶2，1∶2∶2∶2∶4 6～10. 1～5組的陰性對照

圖3 不同濃度的引物進行多重PCR擴增

Figure 3 Amplification of multiple PCR using primers with different concentrations

M. 2 K Maker 1～4.Taq酶添加量分別為0.25，0.50，1.00，1.50 μL 5～8. 1～4組的陰性對照

圖4 多重PCR體系中添加不同體積Taq酶的擴增結果

Figure 4 Amplification of multiple PCR usingTaqwith different concentrations

M. 2 K Maker 1～4. 退火溫度分別為53，55，57，58 ℃ 5～8. 1～4組的陰性對照

圖5 不同退火溫度對多重PCR擴增的影響

Figure 5 Amplification of multiple PCR with different annealing Temperature

2.3 多重PCR的靈敏度和特異性

為了確定多重PCR體系的靈敏度，基于優化的PCR擴增條件和反應程序，將含104CFU/g菌落的粗提DNA混合模板稀釋成10.00%，1.00%，0.10%分別進行擴增。結果表明，當混合DNA模板被稀釋到0.10%時，使用本方法已檢測不到tetS基因，而1.00%的稀釋模板仍能擴增出所有5條目的條帶(圖6)。因此，本多重PCR反應的靈敏度為102CFU/g。

以13種耐藥基因的陽性克隆菌株的粗提DNA為模板，用優化的多重PCR體系進行擴增，考察體系的特異性。結果表明，本方法僅可以檢測5種目的耐藥基因，對不含目的耐藥基因的樣品無法擴增出條帶(圖7)。因此本多重PCR體系具有較好的特異性。

M. 2 K Maker 1～4. 模板稀釋梯度分別為10-3，10-2，10-1，1005～8. 1～4組的陰性對照

圖6 不同稀釋梯度的混合DNA模板的多重PCR擴增結果

Figure 6 Amplification of multiple PCR using templates with different dilutions

1～16. 分別以tetA、tetA+tetD、tetA+tetG、tetS、tetX、sul1、sul2、tetE、tetM、tetT、tetO、tetR、tetA+tetX、tetA+tetS、tetA+sul1、tetA+tetX+tetS的陽性克隆菌為模板進行PCR擴增的樣品 M. 2 K Maker -. 陰性對照

圖7 特異性驗證結果

Figure 7 Specificity of the multi-PCR system

2.4 禽源四環素耐藥菌的耐藥基因檢測

用建立的多重PCR體系和反應程序檢測23株本實驗室篩查獲得并鑒定保存的禽源四環素耐藥菌，檢測結果與普通單重PCR檢測結果完全一致(表3，圖8)。23株禽源耐藥菌屬于11個種屬，包括肉桿菌(Carnobacteriumsp)、溶酪大球菌 (Macrococcuscaseolyticus)、鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriumsp)、氣單胞菌(Aeromonassp)、假單胞菌(Pseudomonassp)、熱死環絲菌(Brochothrixthermosphacta)、庫特氏菌(Kurthiasp)、寡養單胞菌(Stenotrophomonassp)、乳酸菌(lacticacidbacterium)、海洋類香味菌(Myroidesmarinus)、不動桿菌(Acinetobactersp)，且既有革蘭氏陰性菌又有革蘭氏陽性菌。因此，本研究建立的多重PCR體系能廣譜地應用于禽源細菌的5種耐藥基因篩查檢測。

M. 2 K Maker 1～23. 實驗室篩查獲得并鑒定的四環素耐藥菌菌株 -. 陰性對照

圖8 用多重PCR篩查23株四環素耐藥菌中5種四環素耐藥基因的存在情況

Figure 8 Screening of five tetracycline resistance genes by multi-PCR system in 23 poultry isolates of tetracycline resistant bacteria

3 結論

本試驗通過優化四環素耐藥基因引物的濃度、TaqDNA聚合酶濃度和退火溫度等因素，建立了可以同時檢測5種四環素耐藥基因tetA、tetX、tetG、tetD和tetS的多重PCR方法，靈敏度為102CFU/mL，可用于雞源革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌中四環素耐藥基因的快速篩查。目前已發現40多種四環素耐藥基因[1]，且在雞肉產品[5]和飼養環境[24-25]中還存在除本研究所涉5種基因以外的其他多種四環素耐藥基因，因此，還需繼續開發其他禽源四環素耐藥基因的多重PCR檢測技術，以滿足細菌中四環素耐藥基因的大規模篩查研究的需求。