干法糖基化改性玉米醇溶蛋白產物的物化特性及在膠囊殼中的應用

張慧君陳又銘宮春宇姜寧寧沙迪昕王文霞

ZHANG Hui-jun1,2 CHEN You-ming1,2 GONG Chun-yu1,2 JIANG Ning-ning1,2 SHA Di-xin1,2 WANG Wen-xia1,2

(1. 齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2. 黑龍江省普通高校農產品加工重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

(1. College of Food Bioengineering, Qiqihar, Heilongjiang 161006, China; 2. Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province, Qiqihar University, Qiqihar, Heilongjiang 161006, China)

玉米是世界三大糧食作物之一，因產量、可利用價值高且可再生而受到廣泛的關注。濕磨法是加工淀粉及其以淀粉為原料深加工產物的主要方法，該方法突出的特點是將玉米的各個組成部分有效地分離，如玉米濕法加工的副產品中，大約可以分離出占原料質量5%～6%的玉米黃粉(Corn Gluten Meal，CGM)，其中蛋白質含量約60%，主要成分為玉米醇溶蛋白(zein)等[1]。

由于玉米醇溶蛋白富含大量疏水性氨基酸，存在溶解性差，口感粗糙及含有色澤和不良氣味等問題，長期以來許多工廠將玉米黃粉主要用作低價值動物蛋白飼料，極少在食品工業中應用。但另一方面因為玉米醇溶蛋白的特殊氨基酸結構，使它能在無需添加劑、鞣制劑的條件下制成具有良好阻濕性及阻氧性、透明度高的薄膜。目前，國內外對玉米醇溶蛋白的研究主要集中在果蔬、食品保藏等方面的應用，如玉米醇溶蛋白膜配方及成膜條件的篩選等[2]。但是這種純玉米醇溶蛋白制備的膜，其抗拉強度、延展性等機械性能指標不理想，如剛性強、易斷裂、柔軟性差，因此它的使用受到限制，作為膠囊壁材的資料更少。

蛋白質改性即利用各種外界因素改變氨基酸殘基和多肽鏈，使蛋白質分子空間結構和理化性質發生改變，從而獲得符合要求的蛋白特性[3-5]。糖基化改性是近年來常用的、安全的蛋白質改性方法，包括干熱法和濕熱法。由于濕熱法適合制備單糖、雙糖或低聚糖-蛋白質共價復合物，但是單糖的性質不如干熱法中使用的多糖那么突出。干熱法利用蛋白質和多糖發生糖基化反應[6]，可在適當的相對濕度和反應溫度范圍內使蛋白質中的氨基處于聚集松散狀態，且多糖僅有一個還原末端，有利于與羰基發生接枝交聯，反應產物的機械性能和功能性都比較好。如原秀玲等[7]的研究表明海藻酸鈉干法糖基化改性乳清蛋白成膜性和膜的機械性有很大改善，林偉靜[8]用糖基化改性花生蛋白后制備膜的機械性能也有明顯提高。

菊粉(多聚果糖，inulin)作為功能性多糖，具有促進礦物質吸收、維生素合成和預防癌癥等作用[9]。目前尚未見采用菊粉對純玉米醇溶蛋白進行改性的相關研究報道，本研究擬利用菊粉在玉米醇溶蛋白上導入羰基，在膜的周圍形成立體網絡結構，提高膜的抗拉強度，以期為制備植物蛋白膠囊壁材料提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白：70%乙醇提取，蛋白含量90%，自制；

菊粉：DP>10，純度>95%，佐源生物工程科技有限公司；

α-淀粉酶：7×104U/mL，寧夏夏盛實業集團有限公司；

鄰苯二甲醛：化學純，天津市光復精細化工研究所；

十二烷基硫酸鈉：電泳級，天津市耀華化學試劑公司；

β-巰基乙醇：分析純，天津市北聯精細化學品開發公司；

硼砂：分析純，天津市東麗區天大化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

質構儀：QTS-25型，美國博樂飛公司；

差示掃描量熱儀：Q-20DSC型，美國TA儀器公司；

掃描電子顯微鏡：s-3400型，日本日立有限公司；

超聲波信號發生器：WSL-1000D型，南京順流儀器有限公司；

真空冷凍干燥機：LYOQUEST-85型，西班牙泰士達公司；

傅里葉變紅外光譜分析儀；FI-IR/NIR型，美國PerkinElmer公司；

數顯膜測厚儀：GBCY01型，浙江盛泰芯電子科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 干法糖基化反應 稱取玉米醇溶蛋白，用70%乙醇溶液溶解，配制成8%的玉米醇溶蛋白乙醇溶液，按比例加入一定質量的菊粉，混勻，調節體系pH，超聲(500 W，10 min)，凍干，打磨成粉，倒入平皿，置于相對濕度為79%的溴化鉀溶液、在溫度60 ℃的干燥器內反應一定時間，得到玉米醇溶蛋白-菊粉的糖基化改性產物。

1.3.2 膜和膠囊殼的制備 稱取糖基化改性產物，用70%乙醇溶解配成8%的樣品溶液，在65 ℃下磁力攪拌30 min進行溶膠。將溶膠倒入不銹鋼模具于70 ℃烘箱烘干成膜；將溶膠預熱至70 ℃、在涂有植物油的1#膠囊殼模具上進行蘸膠，烘干后，取出膠囊殼。將烘干后的膜或膠囊殼于溫度30 ℃、相對濕度43%干燥器內平衡48 h，進行測定。

1.3.3 測定項目與方法

(1) 蛋白膜TS測定：將制備的改性膜剪成4 cm×1 cm的長方形狀，置于質構儀拉伸探頭上，固定好，夾距設定為20 cm，拉伸速度為5 mm/s。抗拉強度按式(1)計算：

(1)

式中：

TS——抗拉強度，MPa；

F——最大拉力，N；

L——膜樣品的厚度，mm(在膜的邊緣及中心等位置均勻取10個點，利用測厚儀測定其厚度，取平均值)；

W——膜樣品的寬度，mm。

(2) 玉米醇溶蛋白改性后的SDS-PAGE凝膠電泳測定：采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法檢測，考馬斯亮藍R-250染料，形成藍色條帶。糖基化改性后得到的糖蛋白產物的定性檢測使用高碘酸-Schiff試劑法，得到粉紅色或淺紅色條帶。

準確稱取玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白-菊粉糖基化改性產物的凍干樣品(最佳工藝條件下)，用70%乙醇溶液溶解，配制成1 mg/mL的樣品蛋白溶液，于10 000 r/min離心10 min，取上清液，用分離膠濃度12%，濃縮膠4%，進樣10 μL。恒壓控制，濃縮膠80 V，分離膠100 V。至樣品帶遷移到距離膠板底部1 cm左右停止電泳。同時，以低分子量標準蛋白作為蛋白的標準樣品，辣根過氧化物酶作為糖基化產物的標準樣品。

(3) 蛋白膜紅外光譜掃描：采用傅里葉變紅外光譜分析儀測試，掃描范圍為500～4 000 cm-1，掃描范圍次數32次，分辨4 cm-1。

(4) 熱力學性質測定：利用差示掃描量熱儀(DSC)在20～250 ℃內掃描，升溫速度為10 ℃/min，測定玉米醇溶蛋白膜和玉米醇溶蛋白-菊粉糖基化改性膜的熱性質。

(5) 蛋白膜微觀結構測定：將玉米醇溶蛋白膜和共價交聯產物膜，剪成0.5 mm2的試驗片，進行真空鍍金處理，加速電壓15 kV。將樣品放入掃描電子顯微鏡(SEM)中觀察拍照。

2 結果與分析

2.1 不同種類膜抗拉強度比較

分別測定改性后的玉米醇溶蛋白-菊粉膜、玉米醇溶蛋白膜、明膠膜的抗拉強度，結果見圖1。

由圖1可知，制備膠囊殼的明膠膜抗拉強度為8.23 MPa、玉米醇溶蛋白膜為4.67 MPa、玉米醇溶蛋白-菊粉膜為11.5 MPa，說明改性后的蛋白膜抗拉強度得到提高。

2.2 SDS-PAGE凝膠電泳分析

圖2為玉米醇溶蛋白和、玉米醇溶蛋白與菊粉進行糖基化反應后的考馬斯亮藍染色圖和糖蛋白紅色染色圖，0和0′泳道的標樣分別為14 400～97 400 Da的低分子量標準蛋白和辣根過氧化物酶。

圖1 不同膜的抗拉強度

0. 標準蛋白 1. 玉米醇溶蛋白 2. 玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿接枝物 3. 玉米醇溶蛋白-麥芽糊精接枝物 4. 玉米醇溶蛋白-菊粉接枝物 0′. 辣根過氧化物酶 1′. 玉米醇溶蛋白 2′. 玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿接枝物 3′. 玉米醇溶蛋白-麥芽糊精接枝物 4′. 玉米醇溶蛋白-菊粉接枝物

圖2 SDS-PAGE考馬斯亮藍和糖蛋白染色圖

Figure 2 The electrophoretic profile of the samples stained for zein and zein-inulin

根據文獻[10]，按照溶解性和分子量，玉米醇溶蛋白可分為α-玉米醇溶蛋白、β-玉米醇溶蛋白、γ-玉米醇溶蛋白和δ-玉米醇溶蛋白四類。其中α-玉米醇溶蛋白主要是疏水性氨基酸，約占總玉米醇溶蛋白含量的75%～80%，β-玉米醇溶蛋白和γ-玉米醇溶蛋白含量約各占總玉米醇溶蛋白的10%，剩下是含量很少的δ-玉米醇溶蛋白。α-玉米醇溶蛋白分子量為23～24 kDa和26～27 kDa；β-玉米醇溶蛋白分子量約為17 kDa，γ-玉米醇溶蛋白分子量為27 kDa和18 kDa；δ-玉米醇溶蛋白分子量約為10 kDa。

由圖2可知，考馬斯亮藍染色的電泳中，1泳道的條帶中為玉米醇溶蛋白組分，其中分子量分布與文獻[10]一致，主要集中在α玉米醇溶蛋白的24～26 kDa以及少量的β-玉米醇溶蛋白(17 kDa)和雜蛋白(38 kDa以上)。4泳道為改性后的玉米醇溶蛋白-菊粉，由于菊粉的分子量(341～10 000 Da)遠遠低于玉米醇溶蛋白，因此接枝反應后，第1和第4泳道的條帶位置改變不大，糖蛋白在考馬斯亮藍中無明顯的改變，無法鑒定是否進行了糖基化反應。因此，采用高碘酸希爾法，利用高碘酸的氧化作用與多糖分子進行顏色反應，以辣根過氧化物酶為陽性對照，以檢測接枝產物中是否有糖分子的存在。圖2中，1′泳道的玉米醇溶蛋白呈現淺淺的紅色，說明玉米醇溶蛋白本身含有少量的糖，與李海明[11]的研究結果一致。4′泳道為菊粉改性產物，顯示紅色條帶，證明糖基化反應生成的交聯產物玉米醇溶蛋白-菊粉中有糖基的存在，從而確認玉米醇溶蛋白中導入了菊粉分子。

2.3 蛋白膜FT-IR分析

采用玉米醇溶蛋白與菊粉進行干法糖基化，與玉米醇溶蛋白膜作對比，進行傅里葉紅外光譜分析，結果見圖3。

圖3 玉米醇溶蛋白膜和玉米醇溶蛋白—菊粉膜的FT-IR光譜圖

由圖3可知，當蛋白質與多糖分子以共價鍵接枝后，蛋白質分子中羥基的含量就會增加，在紅外光譜的譜圖中會發現羥基的特征吸收峰先后增強。羥基的特征吸收峰有2個，分別是—OH伸縮振動吸收峰(3 700～3 200 cm-1)和C—O伸縮振動吸收峰(1 100～1 000 cm-1)。蛋白質的特征吸收峰包括酰胺Ⅰ帶—NH彎曲振動(1 690～1 630 cm-1)、酰胺Ⅱ帶—NH彎曲振動(1 530～1 560 cm-1)和酰胺Ⅲ帶C—N彎曲振動和N—H彎曲振動(1 240～1 450 cm-1)。

從圖3還可以看出，相比未改性的玉米醇溶蛋白膜，干熱法改性玉米醇溶蛋白-菊粉膜在3 290.46 cm-1處的峰移至3 288.68 cm-1處、酰胺Ⅰ帶的叔酰胺1 645.99 cm-1處的峰移至1 643.28 cm-1處，酰胺Ⅱ帶的仲酰胺1 536.82 cm-1處的峰移至1 517.18 cm-1處，酰胺Ⅲ帶的1 242.85 cm-1處的峰移至1 239.03 cm-1處，振動吸收峰變小發生藍移，其中1 643.28 cm-1處峰的藍移來自于糖基化反應后玉米醇溶蛋白的α-螺旋結構減少，減少的α-螺旋結構部分轉化成β-折疊。對此結果進行分析，推測為：相比純的玉米醇溶蛋白，干法糖基化改性后的玉米醇溶蛋白-菊粉引入了新的多聚果糖鏈導致接枝后產物的結構中β-折疊含量增加，強化了蛋白質分子間及分子內的相互作用，使改性后產物的穩定性增加[12]；另外，改性的膜在1 025.15 cm-1處生成了新的峰，它是C—O伸縮振動吸收峰，即羥基含量增加。這兩點說明原來玉米醇溶蛋白經干法糖基化后二級結構發生了變化，與菊粉產生了共價交聯。FT-IR測定結果可較好詮釋改性膜機械性能提高的機理。

2.4 熱性質分析

蛋白質是一種非結晶態的三維結構，其非共價鍵的相互作用決定了結構的穩定性，使蛋白質具有玻璃態轉化行為。玻璃態轉化溫度取決于蛋白質分子的空間效應和分子間、分子內的相互作用。玉米醇溶蛋白與干法糖基化的DSC掃描結果見圖4。

圖4 玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白-菊粉的DSC圖

由圖4可知，玉米醇溶蛋白膜的熱變性溫度約188.47 ℃，菊粉對玉米醇溶蛋白糖基化改性以后，改性交聯產物的熱變性溫度升高到194.02 ℃。當玉米醇溶蛋白與菊粉發生了糖基化反應時，玉米醇溶蛋白蛋白的空間結構和鍵位都會發生一定的變化,從而導致熱吸收數據發生變化。熱變性溫度的提高說明蛋白質的內部結構更加穩定，即通過糖基化的方法對玉米醇溶蛋白改性可提高玉米醇溶蛋白的熱穩定性，與紅外結果一致。

2.5 蛋白膜SEM分析

圖5表明了玉米醇溶蛋白膜和玉米醇溶蛋白-菊粉膜的表面微觀結構在放大1 000，2 000，5 000，10 000倍后的差異。

a～d. 玉米醇溶蛋白膜放大1 000，2 000，5 000，10 000倍a′～d′. 玉米醇溶蛋白-菊粉膜放大1 000，2 000，5 000，10 000倍

品質性能優良的膜表面結構沒有太多的孔洞、凹陷、突斑和裂紋。如圖5所示，以純玉米醇溶蛋白膜作為對照，利用SEM對玉米醇溶蛋白膜和玉米醇溶蛋白-菊粉膜表面放大1 000倍進行觀察，純玉米醇溶蛋白制備的膜表面存在微小的孔洞結構；糖基化改性后玉米醇溶蛋白-菊粉制備的膜，比較平整、表面微孔結構消失。將玉米醇溶蛋白膜和玉米醇溶蛋白-菊粉膜同時放大2 000，5 000倍時，結果相同。當將玉米醇溶蛋白膜和玉米醇溶蛋白-菊粉膜放大10 000倍時，可以清楚地看到玉米醇溶蛋白膜表面無規則分布著直徑大小不一的小孔，玉米醇溶蛋白-菊粉膜表面較光滑、平整、沒有孔隙。說明空洞等缺陷是導致膜機械性能差的主要原因，即對膜的抗拉強度造成一定的影響，與圖1的結果一致。進一步證明玉米醇溶蛋白經過菊粉干法糖基化改性，菊粉分子和玉米醇溶蛋白分子發生共價接合，使孔洞結構消失。

2.6 膠囊殼的制備

將玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白-菊粉制備成膠液、經過模具蘸膠、烘干得到1#膠囊殼，按照《中華人民共和國藥典(2015版)》檢測其外觀、膠囊體膠囊帽的松緊度、干燥失重、灼燒殘渣和脆碎度等指標，結果見圖6和表1。

圖6 膠囊殼的制備

由表1可知，玉米醇溶蛋白膠囊殼由于脆性較大，在脫模過程中膠囊殼出現有裂痕，甚至易碎、導致殼體不完整，外觀不合格。而玉米醇溶蛋白-菊粉制備的膠囊殼，各項指標均符合《中華人民共和國藥典2015版》的相應標準，殼體沒有裂縫，套合后的膠囊體無漏粉現象，表面光滑，質地均勻。膠囊的松緊度、灼燒殘渣、脆碎度和干燥失重均合格。

3 結論

本研究采用干熱糖基化對玉米醇溶蛋白進行改性，制備了玉米醇溶蛋白-多聚果糖共價接枝產物，研究了糖基化改性對玉米醇溶蛋白結構和機械性能的影響。初步探討了改性反應的機理。通過SDS-PAGE凝膠電泳、DSC、紅外光譜和掃描電鏡分析得出，玉米醇溶蛋白以共價鍵的形式有效地接入多聚果糖分子，使改性蛋白質的化學結構發生改變，膜的孔洞結構消失，提高了抗拉強度。說明利用菊粉對玉米醇溶蛋白糖基化改性是提高膠囊殼機械強度，替代明膠膠囊的有效方法。

本研究從膜的機械性能、紅外結構、熱力學和微觀掃描等方面綜合分析，干法糖基化制得膠囊殼的各項指標滿足了《中華人民共和國藥典》的要求。因此后期擬在干法糖基化的原料方面作進一步的篩選，盡可能選擇成本更低，更常見的食品添加劑類多糖作為糖基化原料。此外，玉米醇溶蛋白具有天然腸溶性，探索改性后的膠囊殼對腸溶效果的變化是今后研究發展的方向。

表1 檢測指標