CFTR特異性抑制劑CFTRinh-172的高通量篩選與研究進展

欒 劍

LUAN Jian

(吉林師范大學生命科學學院，吉林 四平 136000)

(College of Life Science, Jilin Normal University, Siping, Jilin 136000, China)

囊性纖維化跨膜轉運調節因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)是一種定位于上皮細胞頂膜的氯離子通道，在囊性纖維化、多囊腎病、分泌性腹瀉等疾病的發病機制中，扮演重要的角色。遺傳性致死疾病囊性纖維化，是由于CFTR基因的突變造成，簡單一個基因位點的缺失就造成整個機體所有CFTR氯離子通道功能的不足，影響著呼吸系統、消化系統、運動系統、循環系統和生殖系統的正常運作，病人平均壽命只有30余年。而當CFTR氯離子通道功能被過度激活時，會造成多囊腎病、白血病和霍亂等嚴重的疾病癥狀。因此，自1989年CFTR基因被鑒別出來之后[1]，在學界造成巨大轟動，多個團隊接連報道了多項高水平的研究，對CFTR的認識到達了前所未有的高度[2-5]。而能夠有效調節CFTR氯離子通道活性的調節劑(包括激活劑和抑制劑兩大類)也進入科研視野，迅速成為了科學研究和藥物研發的熱點。

自從CFTR調節劑的重要性被認知以來，相對于高親和力高特異性的CFTR激活劑的大量涌現，抑制劑的發現和研究就顯得推進緩慢，因此，每一個抑制劑的發現都顯得彌足珍貴。早期的CFTR抑制劑的兩大類是芳基氨基苯甲酸鹽和磺酰脲類，這些物質可以進入CFTR氯離子通道的空隙當中，并通過機械性的堵塞方式，暫時性地阻止流動的一價陰離子,直到抑制劑被洗脫。芳基氨基苯甲酸中典型的有5-硝基-2-(3-苯基丙基胺)-苯甲酸(NPPB)， 有報道[6]指出，該類化合物并不是CFTR氯離子通道特異性的抑制劑，膜片鉗試驗表明是對CFTR-電壓依賴性的抑制而導致CFTR氯離子通道的閉鎖。早期的磺酰脲類化合物主要是作為抑菌劑在使用，其中格列本脲在更高濃度下可以抑制CFTR[7]，其作用機制是通過在CFTR氯離子通道處于開放狀態時，與孔道結合并堵塞，從而達到抑制的作用[8]。雖然以上兩類化合物可以抑制CFTR氯離子通道，但是，通常需要較高的濃度(>1×10-4mol)才能達到較好的效果[9]，根源在于非特異性抑制劑會同時使得其下游的多種離子通道和細胞膜表面轉運子都會受到影響。這些早期發現的CFTR氯離子通道的阻斷物是一組結構多樣的帶陰離子的有機大分子，表明阻斷物從胞質末端進入CFTR氯離子通道孔隙的過程幾乎沒有特異性或大小區分。此外，大多數阻斷劑的活性較低，而且由于簡單的堵塞作用機制，這些阻斷劑都是沒有專一性的。這些CFTR阻斷劑的低活性、低專一性的性質大大限制了它們的應用前景。此外，這些物質中的部分還阻斷了其他類型的氯離子通道[10]，使得這類阻斷劑特別容易影響到其他不同的離子通道。顯而易見，專一性強的抑制劑無論在試驗、造模還是藥物研發方面都是極其重要的一個特性，然而，在當時并沒有特異性的CFTR抑制劑被發現。

因此，對于抑制活性強、專一性高的小分子抑制劑的需求日益迫切，亟待一個全新的手段加速對潛在抑制活性的化合物進行測試和篩選。

1 CFTR小分子抑制劑的篩選策略

1.1 小分子化合物庫

天然的小分子活性化合物是當今藥物研發的最主要來源，隨著高通量篩選技術(High Throughput Screening，HTS)的誕生和日趨完善，使得天然活性小分子的快速高效篩選成為了可能，令全球新藥的開發工作有了一個質的飛躍。基于CFTR抑制劑在藥物發現和藥理研究中日趨迫切的訴求，許多CFTR門控調節劑研發的相關課題組都以ChemBridge公司(San Diego，USA)和ChemDiv公司(San Diego，USA)的小分子化合物庫為依托，在共計超過150萬小分子化合物庫中篩選目的藥物的先導化合物及其結構類似物，并可以依據藥物性質需求對化學結構進行分析乃至定制構建全新結構的化合物。

1.2 細胞系構建

Verkman課題組[11]創造性地構建了穩定遺傳的表達人源CFTR基因和H148Q基因的FRT細胞系，并以此為依托進行CFTR特異性抑制劑的高通量篩選；這種細胞系是以人的野生型CFTR基因和對鹵族元素敏感的綠色熒光蛋白(H148Q)基因穩定共轉染的wt-CFTR-H148Q-FRT細胞系；從報道的穩定性數據來看，構建成功的細胞系可以至少穩定傳代15次而不降低YFP-H148Q熒光效能。

1.3 高通量篩選

將穩定表達野生型CFTR-YFP-H148Q的細胞系鋪板培養。空白對照組加入50 μL saline；陰性對照組加入50 μL 3種混合的激活劑；陽性對照組加入50 μL 混合的激活劑加2×10-5mol CFTRinh-172；樣品組在各孔中加入50 μL 混合的激活劑，于培養箱孵育5 min，再加入0.5 μL的待測化合物。通過配備有HQ500 / 20X激發和HQ535 / 30M發射濾光片(Chroma Technology)的Fluostar酶標儀(BMG LabTechnologies)記錄單個孔內的熒光數據變化[圖1(a)]。細胞表面的CFTR氯離子通道被混合的激活劑預先處理而活化，通道處于開放狀態，鹵族元素離子可以自由出入。由于細胞系表達的綠色熒光蛋白(H148Q)對鹵族元素敏感，當鹵族元素離子經由開放的CFTR氯離子通道進入細胞后，會使熒光猝滅。當Fluostar酶標儀向各個孔道逐一注入NaI溶液時，如果待測化合物能夠抑制CFTR氯離子通道的活性，將會關閉離子通道，則I-進入胞內的量會大幅下降，而監測結果該孔的熒光信號減弱的程度明顯低于對照組[圖1(b)]。分析單通道熒光值的數據，可以高效篩選出具有抑制CFTR氯離子通道活性的小分子化合物。

2 噻唑烷酮小分子CFTR抑制劑

2.1 噻唑烷酮CFTR抑制劑的發現

2002年，Verkman課題組[13]依托于ChemBridge (San Diego，USA)大型的化合物庫對50 000種構象各異的小分子化合物進行高通量篩選，最終得到6種2-thioxo-4-thiazolidinone化學結構的CFTR小分子抑制劑[圖1(c)]。在所有直接篩選獲得的化合物中以噻唑烷酮3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮(CFTRinh-172)的活性最高。對CFTRinh-172的活性分析數據如下：① 在熒光細胞試驗中3×10-4mol的CFTRinh-172對CFTR介導的短路電流在2 min內達到最大值；② 以與電壓無關的方式抑制CFTR；③ 其抑制活性具有可逆性；④ 在細胞培養和小鼠模型中，CFTRinh-172在高濃度下沒有表現出毒害性；⑤ CFTRinh-172的抑制作用具有高度的專一性，在完全抑制CFTR的濃度下，不能阻止細胞cAMP升高，不能抑制非CFTR Cl-通道或其他相關轉運蛋白；⑥ 在6 min內，小鼠單次腹腔注射CFTRinh-172(250 μg/kg)可顯著減少小腸中超過90%的霍亂毒素誘導的腸道液體分泌[13]。CFTRinh-172被報道之后，因其活性好專一性高引起本領域科學家的廣泛興趣，CFTRinh-172構象和活性的種種特點陸續被揭示，被譽為CFTR小分子抑制劑的金標準，目前，依然是CFTR領域科研試驗的標準參照物。

A. 自動高通量篩選的原理圖[12]B. 高通量篩選的流程[13]C. 上部為 2-thioxo-4-thiazolidinone CFTR抑制劑的化學構架，底部為6種有最好的CFTR抑制活性的結構類似物[13]

圖1 高通量篩選CFTR氯離子通道抑制劑

Figure 1 High-throughput screening to identify CFTR inhibitors

2.2 噻唑烷酮CFTR抑制劑的構象

噻唑烷酮是一種飽和形式的噻唑烷，它的第4個碳上有羰基，被認為是一種具有幾乎所有生物活性類型的神奇的核[14]。Verkman團隊[15]合成了58種CFTRinh-172的結構類似物，以鑒定和改善具有較好水溶性的CFTR抑制劑。如圖2所示，A環3位上的—CF3、B環上含有噻唑烷酮的核心以及 C環4號位上的羧基化合物對于CFTR的抑制作用最強。同時，還鑒定了2種具有很高抑制活性的化合物：Tetrazolo-172和Oxo-172，它們還兼具了較好的水溶性和較低的毒性，這樣的結構探索使得CFTRinh-172成為相關CFTR抑制劑研究和開發的先導化合物，不斷受到追捧。

2.3 噻唑烷酮CFTR抑制劑的作用機制

2002年之前發現的CFTR抑制劑都是通過簡單的機械堵塞作用來阻斷細胞質一側的孔道，故而活性和專一性都較差。而CFTRinh-172分子在正常生理pH值下含有一個負電荷，并以一種與電壓無關的方式阻斷CFTR介導的 Cl-電流[13]。Taddei等[16]指出單通道電壓膜片鉗數據顯示CFTRinh-172阻斷CFTR氯離子通道導致通道平均閉合時間延長，而不改變通道平均開放時間。這種影響是由于平均通道關閉時間延長而沒有改變平均通道開放時間。 短路電流試驗[17]表明抑制野生型G551D和G1349D CFTR中Cl-電流的CFTRinh-172抑制效力相似；然而，對于ΔF508CFTR，Ki則顯著降低。CFTRinh-172的應用導致平均關閉時間的延長和頻道平均開放時間的縮短。數據[18]分析可見，CFTRinh-172不僅僅是簡單的孔隙阻斷劑：① CFTRinh-172 可以同時在CFTR氯離子通道開放和閉合2種不同的狀態下與之結合；② CFTRinh-172結合引發了CFTR蛋白的變構效應，起到抑制CFTR的作用，這明顯與簡單的堵孔的方式不同；③ CFTRinh-172的效力與開放時間之間的關系：開放時間越長，IC50就越低；④ 不能通過干擾NBD二聚體發揮作用。

圖2 噻唑烷酮CFTR抑制劑的結構活性分析 [15]

2.4 CFTRinh-172的藥代動力學研究

使用14C標記的CFTRinh-172，液相色譜及質譜聯用以及小鼠腸道閉環模型分析研究CFTRinh-172藥理學和嚙齒動物的抗腹瀉效力，發現：① CFTRinh-172主要通過腎小球濾過而未經化學修飾而被清除；② CFTRinh-172在小鼠靜脈輸注后5 min內在肝中累積，此時膽汁中濃度是血液的5倍；③ 在給藥30～240 min時，CFTRinh-172主要富集在肝、腸和腎中，在腦、心臟、骨骼肌和肺中幾乎檢測不到；④ 大鼠靜脈推注后的藥代動力學分析顯示，分布容量為770 mL，再分布和消除半衰期分別為0.14，10.30 h；⑤ CFTRinh-172在肝微粒體中穩定；⑥ 小鼠腸道閉環模型研究表明，單次腹腔注射20 mg的 CFTRinh-172可抑制霍亂毒素在十二指腸和空腸中的累積，在6 h后>90%，回腸中為60%和結腸中則不足10%；⑦ 在小鼠出生后6周內，高劑量CFTRinh-172給藥[3 mg/(kg·d)，每日2次劑量]沒有觀察到毒性[19-20]?？梢哉f，CFTRinh-172的代謝穩定性、腸肝循環、腎功能減退、腸內蓄積等特性是其良好止瀉作用的主要原因。

3 噻唑烷酮CFTR抑制劑與疾病

3.1 分泌性腹瀉

前面提到，CFTR氯離子通道是Cl-跨越腸道上皮細胞頂膜運輸的主要途徑，當CFTR氯離子通道受到腸毒素影響而功能亢進時，Cl-等電解質由小腸上皮細胞被大量排放到腸腔，從而驅動水分在滲透壓作用下流失，是分泌性腹瀉發病機制的關鍵性節點[21]。小分子CFTR抑制劑可減少動物模型中腸毒素誘導的腸道液體分泌。通過CFTRinh-172等專一性抑制劑關閉CFTR氯離子通道，在不干擾其他正常運轉的離子通道和轉運子的前提下，阻斷電解質流失，成為治療分泌性腹瀉的新策略[22-23]。 在大鼠閉環模型中，單次腹膜內注射200 μg的CFTRinh-172阻斷了90%以上的霍亂毒素和70% STa大腸桿菌毒素所誘導的腸液分泌；而在小鼠開環霍亂模型中，通過口服方法給藥的CFTRinh-172降低了≥90% 的霍亂毒素誘導的腸道液體分泌量[24]。CFTRinh-172顯著降低由cAMP依賴的霍亂弧菌，大腸桿菌和霍亂弧菌等病菌分泌的腸毒素引起的腸道內電解質分泌和水分流失，因此可以有效減少感染性、分泌性腹瀉中的腸道液體分泌。

圖3 腸道分泌途徑[22]

3.2 多囊腎病

多囊腎病(PKD)是一種人類遺傳性腎臟疾病，會導致腎功能衰竭。多囊腎病目前還沒有獲得批準的藥物或是有效的預防策略，患者只能接受透析和腎臟移植。有報道[25]指出CFTRinh-172可以在MDCK細胞培養模型中抑制PKD囊腫的生長。后續有體外試驗[26]表明，CFTRinh-172在腎上腺器官的培養中起到延緩囊腫生長的作用。其后有數據[27-28]顯示，CFTRinh-172在試驗中幾乎完全抑制囊腫生長而不影響細胞增殖，同時還表現出了對囊腫數量和胚胎腎囊腫模型生長的顯著抑制；對新生兒腎特異性PKD1敲除小鼠進行皮下注射，治療小鼠7 d，對腎腫大、囊腫擴張和腎功能損害顯著降低，這些結果表明CFTR抑制劑具有減少PKD中囊腫生長的潛力。需要注意的是，如果選擇長期通過CFTR抑制劑治療，意味著需要抑制超過九成的CFTR氯離子通道，而這勢必會影響到呼吸系統、消化系統乃至生殖系統正常的功能。因此，CFTRinh-172投入使用尚需進一步的臨床前評估來判斷。

3.3 白血病

CFTR的異常表達或突變會導致一系列疾病，其中包括白血病[29]和胰腺癌[30]這樣的惡性腫瘤。Yan等[31]報道CFTRinh-172可以在K562和SUP-B15細胞中降低HDAC2蛋白的表達，并導致PTEN在mRNA和蛋白質水平的增加以及PDK1和mTOR(PTEN的下游信號傳導)活性的降低，而MTT試驗顯示CFTRinh-172可在Ph+白血病細胞中增強HDAC2的抑制劑的抗增殖作用。CFTR在急性髓系白血病患者及白血病細胞中均顯著呈高表達。TF1細胞中加入CFTR特異性抑制劑后，細胞的活力下降，細胞凋亡率顯著增加。CFTRinh-172可以抑制CFTR，通過經典的Wnt信號通路抑制白血病細胞株TF1的生長，并促進其凋亡[32]。

4 結論與展望

CFTR功能亢進會導致分泌性腹瀉(如與霍亂相關的腹瀉)腸道液體分泌過多[33]。常染色體顯性遺傳性多囊腎病(ADPKD)是最常見的遺傳性腎病，腎上皮細胞CFTR介導的Cl-轉運也是常染色體顯性遺傳性多囊腎病(ADPKD)腎囊腫積液和生長的基礎[34]。CFTR在這種常見和嚴重疾病狀態中的參與使其成為治療干預的一個有吸引力的靶點，而CFTRinh-172因為直接與CFTR蛋白相互作用，高親和性、高專一性被證明是極其有用的試驗工具和先導化合物。

近年來，在CFTRinh-172發現之后，高通量篩選技術已被用于識別更有效的CFTR抑制劑，GlyH-101[35]、iOWH032[36-37]、PPQ-102[38]、Oridonin[39]等小分子化合物先后被篩選面世，獲得很高評價，而天然產物中的化合物，如cocoa flavanols[40]、EGCG和ECG[41]因為其安全性也備受肯定。其中，CFTRinh-172抑制細胞膜細胞質側的CFTR，而GlyH-101引起膜外側的電壓依賴性阻滯，它們通過不同的機制抑制CFTR。CFTRinh-172已被證明能優先與開放通道結合，可能會引發構象變化，使其失活。由于不同的側向作用，CFTRinh-172應用于膜的胞內側時優先，GlyH-101應用于胞外，但是這2種較強的選擇性抑制劑至今依然是試驗中抑制CFTR活性的首選藥物。

有報道[42]指出CFTRinh-172在無CFTR氯離子通道蛋白表達的細胞中會誘導活性氧的產生，并導致線粒體功能的衰竭。由于存在潛在風險，對于CFTRinh-172的實際應用需要審慎看待，但這些試驗數據與氯化物的運輸損失是否有關還有待于進一步研究。而且，一直被關注的CFTRinh-172水溶性差的問題也需要通過多方面的考量來解決。盡管如此，可以樂觀地預見未來10年必將會誕生CFTR抑制劑新藥來預防和治療多囊腎病、腹瀉病和白血病等惡性疾病，給CFTR相關疾病的藥物研發帶來光明前景。