氮沉降對亞熱帶常綠闊葉天然林不同季節土壤微生物群落結構的影響*

鄭裕雄 曹際玲 楊智杰 林成芳 楊玉盛

（福建師范大學濕潤亞熱帶山地生態國家重點實驗室培育基地，福建師范大學地理科學學院，福州 350007）

由于化石燃料燃燒、氮肥施用和集約畜牧業等人為活動的影響，目前陸地上年均大氣氮沉降量已達43.47 Tg·a-1（以氮（N）計，下同），預計至2050年大氣氮沉降量將較2000年增加2倍［1］，而我國亞熱帶地區氮沉降尤為明顯。氮沉降的增加會直接影響陸地生態系統的結構和功能。森林是陸地生態系統的重要組成部分，是大面積氮沉降的直接承受者，因此，氮沉降對森林生態系統的影響已引起廣泛關注［2］。

土壤微生物是森林生態系統養分循環的重要參與者，在土壤碳氮循環中起著極其重要的作用［3］。目前，關于氮沉降對土壤微生物群落結構的影響研究主要集中于北美和歐洲等溫帶地區的森林和草原［4］。相關研究表明，氮沉降可改變土壤微生物生物量，使其群落結構發生分異，改變細菌與真菌的比值［5］。也有研究發現，短期適量的氮添加提高了土壤底物有效性［6］，促進了細菌或真菌等微生物類群的生長［7］。而Zechmeister-Boltenstern等［8］通過模擬氮沉降研究土壤微生物群落結構，并利用磷脂脂肪酸（PLFA）技術分析，發現過量的氮添加（大于等于32 kg·hm-2·a-1）可抑制真菌等土壤微生物類群的生長代謝。此外，土壤微生物對氮沉降的響應還具有季節性差異［9］，Yan等［10］研究氮沉降對不同季節溫帶森林土壤微生物的影響時發現，春秋季節土壤微生物多樣性對氮添加的響應要強于夏季。相比溫帶，亞熱帶森林處于氮富集狀態，土壤較高的氮有效性會影響土壤微生物群落活性［11］。氮富集的亞熱帶森林地區土壤微生物群落對不同水平氮添加的響應是否明顯仍不清楚，因此，了解其響應程度對于了解土壤微生物對未來全球環境變化的響應起到至關重要的作用。同時，亞熱帶地區氣象變化更加復雜，底物有效性在不同季節發生變化，可能導致季節間微生物群落結構差異更加突出。但現有關于亞熱帶森林地區不同水平氮添加及其與季節變化的交互作用對土壤微生物群落結構影響的研究較為鮮見。基于此，本研究假設：（1）亞熱帶森林地區低水平氮添加對土壤微生物群落結構影響不明顯，而高水平氮添加對土壤微生物群落結構產生顯著影響；（2）不同季節微生物群落結構對不同水平氮沉降的響應不相同，在夏季微生物群落結構變化對氮添加的響應強于春、秋和冬季節。

我國亞熱帶森林是全國最重要的森林碳匯，有著極強的能量轉化和物質循環能力［12］。細柄阿丁楓（Altingia gracilipes）是金縷梅科蕈樹屬，其枯枝落葉量大且易于分解，具有培肥土壤、提高地力的作用，是我國亞熱帶地區地帶性植被的建群種之一。本文選取位于福建建甌萬木林自然保護區內保存較為完整的亞熱帶細柄阿丁楓天然林為研究對象，采用不同濃度梯度氮添加實驗模擬大氣氮沉降，通過PLFA分析技術探究氮沉降對亞熱帶森林土壤微生物群落結構影響的季節動態，旨在分析氮沉降對亞熱帶森林地區養分循環的微生物影響機制。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

研究區域位于福建省建甌市萬木林自然保護區，地處武夷山脈東南（27°03′N，118°09′E），氣候類型為中亞熱帶季風氣候。該區域年平均氣溫為19.4℃，年均降水量1 731.4 mm，年均蒸發量1 466 mm，相對濕度81%，全年無霜期達277 d。土壤類型為花崗巖發育的山地紅壤。研究植被群落細柄阿丁楓（Altingia gracilipes）為主要建群種，喬木層主要由細柄阿丁楓（Altingia gracilipes）、少葉黃杞（Engelhardtia fenzelii）、木荷（Schima superba）、浙江桂（Cinnamoum chekiangense）、杜英（Elaeocarpus sylvestris）等組成。灌木層以草珊瑚（Sarcandra glabra）和狗骨柴（Tricalysia dubia）為主，草本層以狗脊（Woodwardia japonica）為主。細柄阿丁楓（Altingia gracilipes）樹齡125 a，平均樹高28 m，平均胸徑45.2 cm，密度為每公頃235 株，坡向北偏東15°，坡度27°，海拔390 mm，群落沿山脊向下延伸。土壤基本理化性質為：pH4.48，全氮1.7 g·kg-1，有效磷1.67 mg·kg-1，容重0.90 g·cm-3。

1.2 試驗設計與樣品采集

試驗開始于2009年12月，在細柄阿丁楓天然林隨機設置立地條件基本相似的9塊5 m×5 m樣方，相鄰樣方之間留一條2 m寬的緩沖帶防止相互干擾，并在樣方上方及左右兩邊插入聚氯乙烯（PVC）隔水板，防止下雨時土壤侵蝕造成氮肥流失。參照中亞熱帶地區研究氮沉降處理的強度（36.3 kg·hm-2·a-1），并結合未來大氣氮沉降可能繼續增加的氮沉降趨勢，試驗設置了3個氮水平：對照（CK, 0 kg·hm-2·a-1）、低氮（LN, 50 kg·hm-2·a-1）、高氮（HN，100 kg·hm-2·a-1），每個處理設3次重復。建立樣地后自2010年冬季開始采用硝酸銨（NH4NO3）模擬氮沉降，每月初以溶液的形式在樣地噴灑。按照不同處理水平，將每個樣地所需的氮肥溶解于2 L（相當年降雨量增加約2 mm）去離子水中，用背式噴霧器在林地均勻噴灑，對照樣地噴灑等體積的去離子水，以消除外加水的影響。

模擬氮沉降滿2年后，分別于2012年的春季、夏季、秋季及冬季（2013年1月）采集4次土樣。先去除表面凋落物，再用土鉆在每個小樣方內采用蛇形5點取樣法采集0～10 cm土層土壤，將每個小區內5個點的土樣混合均勻組成1個混合土樣，于24 h內去除植物根系及土壤入侵物，過2 mm篩，用冰袋運回實驗室，-80℃冰箱保存用于土壤微生物磷脂脂肪酸的測定。

1.3 PLFA提取與測定

PLFA的提取：采用氫氧化鉀—甲醇溶液甲酯化方法［13］。（1）稱取10 g鮮土于50 mL玻璃離心管中，加入15 mL 0.2 mol·L-1的氫氧化鉀—甲醇溶液，80 r·min-1低速振蕩5 min后，37℃溫水浴10 min，振蕩和水浴各反復6次浸提；（2）加入3 mL 1.0 mol·L-1的冰醋酸溶液，充分搖勻后，加入10 mL的正己烷，充分搖勻后于4℃、2 000 r·min-1下離心15 min，將上清液轉入玻璃試管內，用高純氮氣吹；（3）在玻璃試管中加入1 mL甲基叔丁基醚—正己烷溶液（體積比為1∶1），手動搖勻，充分溶解后轉入樣品瓶中，-20℃冰箱保存。

PLFA的測定：樣品中加入10μL濃度為1 mol·L-1的正己烷酸甲酯（19∶0）正己烷溶液為內標，采用氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS）（7890A-5973C，Agilent，美國）進行PLFA的測定。

PLFA的命名參照Frostegard方法［14］。PLFA含量用nmol·g-1表示。

以磷脂脂肪酸i14∶0、i15∶0、a15∶0、i16∶0、i17∶0、a17∶0加和表征革蘭氏陽性細菌（Gram-positive bacteria，G+）量，以磷脂脂肪酸16∶1ω7c、16∶1ω7t、18∶1ω7c、18∶1ω7t、cy17∶0、cy19∶0加和表征革蘭氏陰性細菌（Gram-negative bacteria，G-）量，以磷脂脂肪酸i14∶0、i15∶0、a15∶0、i16∶0、i17∶0、a17∶0、16∶1ω7c、16∶1ω7t、18∶1ω7c、18∶1ω7t、cy17∶0、cy19∶0加和表征細菌（Bacteria，B）量，以磷脂脂肪酸18∶1ω9c、18∶2ω6,9c加和表征真菌（Fungi，F）量，以磷脂脂肪酸7Me17∶0、10Me18∶0、10Me19∶0加和表征放線菌（Actinomycetes，Act）量，以磷脂脂肪酸cy17∶0、cy19∶0表征環丙烷脂肪酸（Cyclopropane fatty acids，Cy）量，以磷脂脂肪酸16∶1ω7c、18∶1ω7c表征其前體脂肪酸（Precursor fatty acids，Pre）量，以磷脂脂肪酸i14∶0、i15∶0、i16∶0、i17∶0加和表征順式異構脂肪酸（Isomeric fatty acids，Iso）量，以磷脂脂肪酸a15∶0、a17∶0加和表征反式異構脂肪酸（Anti isomeric fatty acids，Ant）量。

1.4 PLFA相關指數計算

PLFA含量的標定和計算參照劉波等［15］方法，PLFA含量以每克干土中的含量（nmol·g-1）表示，按照以下公式計算：

式中，PPLFA和POSTD分別為樣品脂肪酸和內標C19∶0的峰面積；S為內標c19∶0的濃度，μg·mL-1；V為加入內標c19∶0的體積，μL；MOSTD為內標c19∶0的相對分子量，g·mol-1；m為干土質量，g。

利用PLFA含量計算微生物多樣性指數［16］。香濃-威納（Shannon-Wiener）豐富度指數表征群落中的物種豐富度；辛普森（Simpson）優勢度指數反映群落中最常見的物種。按下列公式計算：

Simpson 優勢度指數：

式中，H′為豐富度指數，D為優勢度指數，ni為第i種的個體數，N為所在群落的所有物種個體之和。

采用響應率分析造成不同氮水平處理下導致類群差異的特定PLFA。響應率計算參照Luo等［17］的方法，當響應值大于0時，微生物群落特定PLFA對氮沉降呈正響應；小于0，則呈負響應。

1.5 數據處理

采用SPSS19.0軟件對數據進行統計分析，用單因素方差分析和圖基（Tukey）多重比較法進行差異顯著性檢驗，比較不同處理土壤微生物群落的差異（P＜0.05），用重復測量方差（Repeated measures data ANOVA，SPSS）分析氮沉降處理與季節交互作用對土壤微生物群落影響和主成分得分值差異顯著性，采用主成分分析（Principal component analysis，PCA）對土壤微生物群落結構進行分析，采用響應率計算分析造成不同氮水平處理下導致類群差異的特定PLFA。繪圖由Origin 9.0和Canoco 5.0軟件完成。數據為平均值±標準差。

2 結 果

2.1 氮沉降對土壤微生物群落PLFA的影響

氮沉降對不同季節土壤微生物PLFA的影響不同（圖1）。土壤微生物以細菌為優勢類群，占微生物總PLFA含量的78.3%。除放線菌外，LN顯著增加夏季土壤微生物群落PLFA，而在其他季節土壤微生物群落總PLFA未產生顯著影響（P＞0.05）；HN顯著降低秋季和冬季土壤微生物群落總PLFA，但增加夏季土壤微生物群落總PLFA。其中，HN顯著降低春季G-和冬季真菌PLFA（P＜0.05）。

圖1 氮沉降對土壤微生物群落結構的影響Fig. 1 Effects of nitrogen deposition on soil microbial community structure

2.2 氮沉降對土壤微生物群落PLFA特征值比值的影響

不同季節中，土壤微生物群落PLFA特征值比值對不同氮沉降處理的響應不同（圖2）。氮沉降并未使F∶B和G+∶G-發生顯著改變。LN增加全年Cy∶Pre和春冬季節Iso∶Ant，而HN顯著增加夏季和秋季Iso∶Ant，對Cy∶Pre未產生顯著影響。

圖2 氮沉降對土壤微生物PLFA特征值比值的影響Fig. 2 Effects of nitrogen deposition on eigenvalue of soil microbial PLFA

2.3 氮沉降對土壤微生物群落多樣性的影響

通過計算2個多樣性指數，Shannon-Wiener物種豐富度指數（H′）和Simpson優勢度指數（D-優勢度），表示土壤微生物群落的多樣性。結果表明，與對照相比，無論LN還是HN對不同季節土壤微生物群落多樣性指數均未產生顯著影響（表1）。

表1 氮沉降對不同季節細柄阿丁楓天然林土壤微生物群落多樣性的影響Table 1 Effects of nitrogen deposition on soil microbial community diversity in Altinglia gracilipes natural forest in the different season

2.4 氮沉降和季節對土壤微生物群落結構的影響

圖3 氮沉降和季節對土壤微生物群落結構影響的主成分分析Fig. 3 Principal component analysis (PCA) of the effects of nitrogen deposition on soil microbial community structure relative to season

為進一步分析氮沉降和季節對土壤微生物群落結構的影響，對土壤PLFA進行主成分分析（圖3），結果表明，主成分1（PC1）對PLFA變異的解釋率達58.21%，主成分2（PC2）的解釋率達到30.01%。LN僅顯著改變夏季土壤微生物群落結構，而HN顯著改變春季和冬季土壤微生物群落結構。夏季土壤微生物群落結構與其他季節發生顯著差異。

土壤微生物群落主成分得分值存在顯著差異（P＜0.05）（表2），表明土壤微生物群落對季節和養分添加產生顯著的變異。

表2 土壤微生物群落主成分得分值差異的顯著性分析（F值）Table 2 Significance analysis of the difference between principal components of the soil microbial community in score value (F value)

土壤微生物總PLFA、細菌、G+、G-、真菌和放線菌特征性磷脂脂肪酸在季節和施氮處理及其交互作用存在極顯著差異性（P＜0.01）（表3），表明微生物PLFA的季節變化隨施氮水平的不同而不同。

表3 季節變化和氮沉降及其相互作用對0～10 cm土壤微生物群落結構影響的顯著性分析Table 3 Significance analysis of the effects of nitrogen deposition, season and their interactions on soil microbial community structure in the 0～10 cm soil layer

2.5 氮沉降對土壤微生物群落特定PLFA的影響

利用響應率曲線進一步分析造成土壤微生物群落差異的特定PLFA（圖4），結果表明，LN處理下，夏季除i17∶0、a17∶0、18∶1ω7c和18∶1ω7t標記物外，細菌、G+、G-和真菌其余PLFA標記物豐度均顯著增加。HN處理下，春季革蘭氏陰性菌16∶1ω7c、16∶1ω7t、18∶1ω7t和cy17:0標記物豐度均顯著下降，冬季真菌18∶1ω9和18∶2ω6,9c標記物豐度均顯著下降。

3 討 論

3.1 氮沉降量對土壤微生物群落結構的影響

氮素作為植物和微生物生長代謝必需的營養元素，適量輸入可為植物生長和微生物的代謝提供營養。目前，大多數研究指出，氮源的輸入會增加土壤微生物生物量，降低土壤微生物群落多樣性［18］。本研究發現，短期適量的氮源輸入（LN）未顯著改變亞熱帶常綠闊葉天然林的土壤微生物多樣性和群落結構。這一結果與氮沉降對亞熱帶杉木人工林土壤微生物群落結構的影響研究結果類似［18］，其原因可能是該地區土壤中氮源相對充足，短期適量的氮添加對微生物多樣性和群落結構影響較小。隨著氮添加量的提高，過量的氮源輸入（HN）導致土壤酸化，改變土壤營養物質的有效性，顯著降低了土壤真菌或細菌類群含量（圖1），使亞熱帶常綠闊葉天然林的微生物群落結構發生顯著分異（圖3）。Demoling等［19］在挪威森林試驗中發現，氮沉降（100 kg·hm-2）加劇土壤碳限制，顯著抑制細菌和真菌的生長速率，導致微生物量和活性分別下降40%和30%。Lu等［20］在我國南亞熱帶成熟林中發現森林生態系統對高氮輸入非常敏感，持續兩年的氮輸入（50～150 kg·hm-2·a-1）顯著加劇土壤酸化。Rousk等［21］研究發現土壤pH是影響微生物群落結構變化的主要因素，其變化對真菌及細菌的生長影響最大。Wang等［22］在氮富集的亞熱帶森林中發現細菌群落組成與土壤的pH成負相關，過量的氮添加（150 kg·hm-2·a-1）顯著降低土壤的pH，導致細菌類群PLFA含量顯著降低。同時，團隊前期研究發現土壤酸化會導致交換性鋁和有機絡合鋁含量增加，鋁形態和含量變化可能會對某些敏感型的微生物類群產生一定的影響［18］。

圖4 氮沉降處理下土壤微生物特定PLFA的變化（95%的置信區間）Fig. 4 Effects of nitrogen deposition on specific PLFA of soil microbes at a 95% confidence interval

不同微生物類群對環境變化的響應程度不同，其特征比值可反映微生物對環境變化的響應能力以及生態系統的穩定性。本研究中氮沉降未對F:B產生顯著影響（圖2），這與黃幸然等［23］對4種亞熱帶樹種進行氮添加時發現不同水平氮添加并未顯著改變真菌/細菌比的結果相一致。這表明，雖然氮沉降對亞熱帶地區天然林某些季節土壤微生物群落結構產生顯著影響，但未顯著改變其生態功能。此外，微生物類群生長代謝的改變會影響到特殊脂肪酸的積累來響應環境變化。Cy∶Pre反映土壤微生物所處的養分壓力狀態，其值越高表明土壤微生物對養分競爭越強。本研究發現LN顯著提高Cy∶Pre，說明適量的氮添加可促進微生物對養分的競爭，這與Zechmeister-Boltenstern等［8］發現氮沉降會顯著增大Cy∶Pre的結果相同。Nilsson等［24］在瑞典南部橡樹進行氮沉降實驗時發現，施氮會增加Cy含量，而降低Pre含量。但導致Cy∶Pre增大的原因尚不清楚，有學者認為可能是因為施氮引起的土壤高滲環境造成的脅迫，或施氮使凋落物產量和生化性質改變，導致異養微生物底物可獲得性改變造成的［25-26］。Iso∶Ant反映微生物對環境脅迫的適應力，其值越高表示土壤微生物對環境脅迫的適應力越強。本研究發現，LN顯著降低夏季Iso∶Ant，這說明微生物間對養分需求的競爭降低對環境變化的適應力，HN顯著降低春冬季節土壤微生物Iso∶Ant，這表明高氮輸入減弱春冬季節微生物群落對環境脅迫的適應力，該結果也表明微生物對環境變化的響應與植物生長、土壤溫濕度和養分有效性等多種因素有關。

3.2 季節和氮沉降量交互作用對土壤微生物群落結構的影響

亞熱帶地區不同季節森林凋落物量、土壤溫度和水分等生物和非生物因素存在明顯的差異，會導致微生物群落發生季節變化，從而改變微生物群落結構對氮沉降的響應程度。Yan等［10］研究發現，氮沉降對不同季節土壤微生物類群的影響不同，且發現與土壤因子的變化密切相關。本研究發現，LN僅顯著改變夏季土壤微生物群落結構，這是由除i17∶0、a17∶0、18∶1ω7c和18∶1ω7t標記物外的細菌、G+、G-和真菌其余PLFA標記物豐度顯著增加所致。夏季植物林下植被生長旺盛，氮素可能較多地被林下植物吸收和降雨淋溶，氮素含量和有效性較低，從而限制土壤微生物的生長。適量的氮添加能增加土壤中氮的有效性，有利于加快微生物類群對易分解有機碳的攝取，從而促進微生物的生長代謝。袁穎紅等［27］在亞熱帶杉木人工林模擬氮沉降時發現，土壤微生物群落對碳源的利用能力在LN最強。Allison等［7］在研究北方森林不同有機質分解時發現，適量的氮添加能最大水平促進真菌的生長和活性提高。HN使常綠闊葉天然林土壤微生物群落結構在春季和冬季發生顯著分異，但不同季節土壤微生物變化類群不同，變化程度也不同。這與田艷琴等［28］發現HN（60 kg·hm-2·a-1）對不同季節柑橘林土壤微生物影響不同的研究結果相似。春季革蘭氏陰性菌16∶1ω7c、16∶1ω7t、18∶1ω7t和cy17∶0標記物豐度均顯著下降，這可能與G-對高氮添加適應力較弱有關。大多數G-分布于根系周圍，主要利用根際沉積物和有效氮進行快速的生長和周轉［29］。春季林木處于短暫而集中的換葉期，導致地面凋落物增多，同時新葉將光合作用產物大量輸送至地下增加細根生物量，但添加的氮超過土壤氮飽和狀態時，會減緩凋落物的分解和降低根系生物量，導致土壤中易分解的有機碳來源減少，使G-對環境脅迫的適應性降低。周世興等［30］在模擬氮沉降對凋落物分解影響時發現，氮沉降顯著抑制凋落物分解，HN處理凋落物質量殘留率較CK高8.81%。冬季真菌18∶1ω9和18∶2ω6,9c標記物豐度均顯著下降，與Demoling等［19］在挪威森林試驗中發現氮沉降能降低真菌18∶2ω6,9c標記物豐度的結果相似。大多數真菌屬于貧營養型，對氮源的需求并不高，在外加氮沉降條件下，其競爭力低于富營養型的細菌，抑制真菌的活性和生長。同時，冬季土壤溫度和含水量均較低，土壤中可利用易變化碳源大量減少，難分解有機碳含量增加，養分流動性降低。土壤微生物為維持正常生長代謝，類群間增大對養分的競爭，從而在有限養分中攝取足夠的營養物質，這與冬季土壤微生物Cy∶Pre比值增大相一致。因此，在考察氮沉降對土壤微生物的影響及機制時，結合植物生長、土壤環境因子和季節等因素，有助于全面評價氮沉降對森林生態系統養分循環的作用機制。

4 結 論

通過模擬不同水平氮沉降，發現夏季土壤微生物群落結構與其他季節發生顯著差異，氮沉降在50 kg·hm-2·a-1水平下僅顯著改變了亞熱帶常綠闊葉天然林夏季土壤微生物群落結構，在100 kg·hm-2·a-1水平下顯著改變了春季和冬季土壤微生物群落結構，但不同季節土壤微生物變化類群不同，變化程度也不同，即氮沉降對土壤微生物的影響表現出一定的季節差異性。因此，在考察氮沉降對亞熱帶地區森林生態系統土壤微生物群落結構的影響時有必要結合季節因素開展。此外，氮沉降未顯著改變土壤微生物群落的多樣性、F∶B和G+∶G-，而使不同結構的環丙烷脂肪酸或異構脂肪酸等特殊脂肪酸比值發生改變，表明亞熱帶常綠闊葉天然林土壤微生物對短期氮沉降具有一定的抵抗能力。