同步熒光法探究硝苯地平與胃蛋白酶熒光基團的作用機制

馬麗花， 劉保生， 邊 剛， 王春丹， 張紅彩， 程 旭

(河北大學化學與環境學院 河北省分析科學技術重點實驗室， 河北 保定 071002)

1 引 言

目前探究藥物與蛋白反應機理的方法主要考察激發波長280,295 nm處隨著藥物濃度改變蛋白熒光猝滅的情況，是研究藥物與蛋白的整體作用[1]。同步熒光法兼具良好選擇性、高靈敏度、窄化譜帶和減小散射干擾等優點[2]。在藥物與蛋白反應機理的研究中，同步熒光法主要用于通過同步熒光峰的位移情況[3]考察蛋白構象的變化。而通過控制發射波長與激發波長差，利用同步熒光法來研究藥物分別與蛋白分子中酪氨酸殘基(Tyr)和色氨酸殘基(Trp)的相互作用機理、熒光猝滅比率份數、結合率、結合模型等，進而在更深層次上揭示藥物分子和蛋白反應機制的研究尚未見報道。考察藥物與蛋白中Tyr和Trp的反應機理對于更加深入地研究藥物的藥理、藥效等有著重要的意義，同時Tyr和Trp含量的變化也可以揭示某些重大疾病的發生與發展情況。有研究表明，腫瘤病人血漿里游離Tyr和Trp的含量減少和腫瘤惡化情況有關[4]，二者可能在人體組織病變中產生了變化。該研究對于治療惡性腫瘤靶向藥物的開發及其藥理、毒理等的研究，也具有一定的指導意義。

硝苯地平(NDP)又稱尼非地平、利血平等，是二氫吡啶類鈣通道阻滯劑的代表，多用于預防和治療心絞痛和冠心病，對于各種類型的高血壓均有較好的療效[5]。胃蛋白酶(PEP)為人體內主要的消化酶，主要存在于胃液中。當NDP被口服后，與胃蛋白酶的結合可能會影響藥物的濃度[6]及PEP的游離濃度。胃蛋白酶與多種藥物的相互作用已有相關報道[7]，但尚未見與NDP之間相互作用的研究，本文以同步熒光法研究了NDP與PEP之間的相互作用，以期為蛋白與藥物結合的研究和NDP臨床用藥的把控提供更直觀細致的參考。

2 實 驗

2.1 儀器與試劑

實驗試劑：胃蛋白酶(PEP，純度≥99%，Sigma公司) 儲備液5.0×10-5mol/L；硝苯地平(NDP，純度>99.8%)用少量無水乙醇溶解，以二次水配成1.15×10-4mol/L儲備液；pH=2.0的HAC-NaAc緩沖溶液(含0.10 mol/L NaCl)。實驗用水皆為二次石英蒸餾水，以上儲備液于4 ℃下避光保存。

實驗儀器：島津RF-5301PC熒光分光光度計(配有1 cm寬度石英比色皿)與UV-3600紫外分光光度計； SYC-15B超級恒溫水浴；SZ-93型自動雙重純水蒸餾器。

實驗中所測熒光強度均采用“內濾光效應”公式進行校正[8]：Icor=Iobs×e(Aex+Aem)/2。所用的乙醇濃度均于相同實驗條件下做空白對比，對蛋白熒光光譜無影響。

2.2 實驗方法

1.0 mL HAC-NaAc緩沖溶液、1.0 mL 2.0×10-5mol/L的PEP溶液及不同體積的NDP溶液，于一系列10 mL比色管中依序加入并以水定容，搖勻，分別在303，310，318 K恒溫水浴30 min。光度計狹縫寬度5 nm，固定Δλ=λem-λex=15 nm或60 nm，掃描同步熒光光譜。

3 結果與討論

3.1 猝滅機理與結合情況

圖1為Δλ=15 nm、60 nm時NDP與P-Tyr、P-Trp反應的同步熒光光譜。NDP的加入分別使P-Tyr、P-Trp的熒光依次猝滅，說明NDP與P-Tyr、P-Trp均發生了相互作用。Δλ=60 nm的同步熒光光譜發生了微弱的紅移，表明NDP使P-Trp周圍的微環境極性增強，疏水性減弱[9]。

猝滅劑與熒光體之間的猝滅方式可以簡單地分作靜態與動態猝滅，也有二者都存在的情況。單一猝滅機制的Stern-Volmer圖上應是直線，由其對溫度的相關性可以區分其作用機制。而靜態與動態聯合作用的情況下則是彎向Y軸的曲線。動態猝滅可由Stern-Volmer方程得出猝滅速率常數Kq和Stern-Volmer猝滅常數Ksv[10]：

I0/I=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]，

(1)

其中I0和I分別為無有猝滅劑的熒光強度；τ0是分子熒光平均壽命(～10-8s)，[Q]是添加的藥物濃度。以I0/I對[Q]作圖，得出Ksv、Kq列于表1。表1中的數據表明：I0/I對[Q]具有良好的線性，而Ksv與Kq均隨溫度上升而增大，說明NDP猝滅P-Tyr、P-Trp熒光的方式應為動態猝滅[11]，即NDP分子與PEP分子彼此擴散和碰撞，從而使PEP的內源熒光猝滅。

蛋白-藥物體系的表觀結合常數Ka和結合位點數n可以由下式求得[12]：

(2)

其中[Bt]為蛋白濃度。計算結果Ka與n皆列于表1。由表1可知，Ka隨溫度上升而明顯增大，也表明NDP對P-Tyr、P-Trp的猝滅方式是動態猝滅。3個溫度下NDP對P-Tyr、P-Trp反應的n值都約為1，表明藥物與蛋白反應只有一個結合位點[13]，Δλ=15 nm時的Ka值明顯小于Δλ=60 nm的Ka值，表明NDP與P-Trp反應程度更強。

CPEP=2.0×10-6 mol/L; 1～12: CNDP=(0, 0.58, 1.15, 1.73, 2.30, 3.46, 4.04, 4.62, 5.20, 5.77, 6.35, 6.93)×10-5 mol/L.

表1 NDP對P-Tyr、P-Trp體系的同步熒光猝滅反應參數

r1為方程I0/I-[Q]的線性相關系數；r2為方程lg[(I0-I)/I]-lg{[Q]-n[Bt]I0-I)/I0}的線性相關系數。

3.2 氨基酸殘基熒光猝滅比率份數與蛋白結合率

以猝滅比率RSFQ表示同步熒光強度降低的程度，RSFQ=1-I/I0[14]，在相同溫度和藥物濃度時分別計算RSFQ(P-Tyr)、RSFQ(P-Trp)值，定義NSFQR(P-Tyr)=(RSFQ(P-Tyr)/(RSFQ(P-Tyr)+RSFQ(P-Trp))×100%為該條件下的P-Tyr熒光猝滅比率份數，則P-Trp的熒光猝滅比率份數NSFQR(P-Trp)=100%-NSFQR(P-Tyr)。取310 K下CNDP/CPEP=(5.8，8.7，14.4，20.2，23.1，28.9)時的NSFQR(P-Tyr)分別為42.18%、45.22%、45.90%、46.32%、47.74%、49.31%，平均值為45.66%，NSFQR(P-Trp)分別為57.82%、54.88%、54.10%、53.67%、53.34%、52.26%，平均值為54.34%。說明P-Tyr與P-Trp均參與了反應，且NSFQR(P-Trp)>NSFQR(P-Tyr)，說明反應位置應更接近P-Trp，證明了3.1的結論。

藥物蛋白結合率是評估其藥性與藥效不可或缺的指標。以表1所得Ka計算NDP與P-Tyr、P-Trp的蛋白結合率。n=1時，結合率(W)公式如下[15]：

(3)

KaR[B0]W2-(KaR[B0]+Ka[B0]+1)W+Ka[B0]=0,

(4)

其中[B0]為蛋白總濃度(～10-3mol/L)，NDP濃度在1.0×10-7～1.0×10-3mol/L之間，R為藥物濃度與蛋白總濃度之比。經計算得298,310,318 K時NDP與P-Tyr的蛋白結合率分別為66.76%～84.68%、69.43%～87.15%、71.04%～88.53%，NDP與P-Trp的蛋白結合率分別為72.22%～89.50%、73.64%～90.60%、74.91%～91.53%。顯然隨著溫度的上升，NDP與P-Tyr、P-Trp的蛋白結合率都分別增大。根據式(4)做出蛋白結合率W與濃度比R的曲線圖如圖2。對310 K時的曲線進行非線性擬合得NDP與P-Tyr結合模型為：W=-0.1109R2+0.07492R+0.8799，相關系數r=0.999 9；NDP與P-Trp的結合模型為：W=-0.1398R2-0.03372R+0.9096，相關系數r=0.999 8。表明當蛋白濃度一定時，藥物濃度增加會減少其蛋白結合率。NDP與兩種氨基酸殘基的蛋白結合率均在90%以上，與NDP實際蛋白結合率92%～98%[16]相近，該結果為NDP的臨床用藥提供了參考，也表明熒光法能夠為計算藥物與蛋白結合時蛋白結合率提供一種簡便易行的方法。

圖2 不同溫度下的NDP對P-Tyr、P-Trp蛋白結合率。(a)Δλ=15 nm；(b)Δλ=60 nm)。

3.3 作用力與藥物協同性考察

熱力學參數焓變ΔH、熵變ΔS、吉布斯自由能變化ΔG可由以下方程求得，以分辨藥物與蛋白分子相互作用的情況：

RlnKa=ΔS-ΔH/T，

(5)

ΔG=ΔH-TΔS，

(6)

其中R為理想氣體常數，T為溫度，Ka為表觀結合常數，得出蛋白與藥物間各項熱力學參數見表2。

表2 不同溫度下NDP -P-Tyr、NDP -P-Trp體系的熱力學參數

由表2可知NDP與P-Tyr、P-Trp相互作用的ΔG均小于0，表明該過程為自發過程；ΔH均大于0，表明NDP與P-Tyr、P-Trp相互作用均為吸熱反應且Δλ=15 nm的ΔH大于Δλ=60 nm，說明NDP與P-Tyr反應需要更多外來能量，高溫時對NDP與P-Tyr的反應更有利，而低溫時NDP與P-Trp反應更容易進行。ΔH與ΔS均為正值，表明NDP與P-Tyr、P-Trp作用力以疏水作用為主[17]。

考察藥物協同性可使用Hill方程[18]：

lgL/(Lm-L)=lgKa+nHlg[Q]，

(7)

式中L=1-I/I0，Lm通過1/L對1/[Q]畫圖得到，nH為Hill系數。nH>1是正協同作用，nH<1是負協同作用，nH=1則是無協同作用，nH結果見表3。從表中數據可知，nH都約為1，說明NDP與P-Tyr或P-Trp的作用將不影響后繼配體與蛋白的結合，表現為零協同作用，且不受溫度的影響。

表3 NDP-P-Tyr、NDP-P-Trp體系的nH值

nH為體系的Hill系數；r3為方程lg[L/(Lm-L)]-lg[Q]的線性相關系數。

3.4 NDP-P-Tyr、NDP-P-Trp間的距離

由F?rster非輻射能量轉移理論，根據以下公式[19]：

(8)

(9)

(10)

其中K2=2/3，N=1.336，Φ=0.15。 P-Tyr或P-Trp的同步熒光光譜與NDP的紫外吸收光譜見圖3。通過公式計算依次得到表4中結果。

從表4可以看出：r均小于7 nm，說明NDP與P-Trp、P-Tyr間都存在非輻射能量轉移[20]。而Δλ=15 nm時的R0、r均大于Δλ=60 nm時的R0、r，意味著NDP分子到P-Trp的作用距離更短，更容易使P-Trp的熒光發生猝滅。隨著溫度的升高，E值都逐漸增加且r值逐漸減小，說明溫度的上升使NDP分子與PEP分子間碰撞加劇，反應速率加快，也表明NDP與P-Trp、P-Tyr的猝滅方式是動態猝滅，與3.1中的結論相同。

圖3 A:PEP的同步熒光光譜(Δλ=15 nm);B:PEP的同步熒光光譜(Δλ=60 nm);C:NDP的紫外吸收光譜(T=298 K,CNDP=CPEP=2.0×10-6 mol/L)。

表4 不同溫度下NDP-P-Tyr、NDP-P-Trp體系之間的結合參數

4 結 論

常規的熒光猝滅法只能探究蛋白-藥物體系的整體性質如結合常數、作用力、結合距離等。而通過固定Δλ=15 nm、Δλ=60 nm，利用同步熒光法可以直接得到藥物與蛋白色氨酸殘基、酪氨酸殘基之間的結合常數、結合位點數、作用力、結合率、結合模型、結合距離及結合程度等。該研究對更加深入地研究藥物與蛋白的作用機制及蛋白在與藥物分子結合中的結合行為均有著重要的意義。