sFRP2和Wnt/β-catenin通路在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用

史友權(quán) 崇楊 湯東 熊清泉,4 黃玉琴,5 周懷成 張琪 金芝祥,5王道榮

近年來結(jié)直腸癌發(fā)病率愈來愈高，在全球腫瘤中發(fā)病率位于第三位，致死率位于第二位［1］。有研究認(rèn)為 sFRP2（Secreted Frizzled-related proteins 2）表達(dá)減少或消失，導(dǎo)致與Wnt蛋白競爭性結(jié)合減少，Wnt/β-catenin通路被激活，β-catenin異常表達(dá)從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展［2-3］。目前關(guān)于sFRP2對結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等研究鮮見相關(guān)報(bào)道。我們檢測了正常結(jié)直腸黏膜組織和結(jié)直腸癌組織中sFRP2和β-catenin的表達(dá)，以及在結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116轉(zhuǎn)染上調(diào)sFRP2后，對比轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖、遷移和侵襲方面的變化，以探討sFRP2和Wnt/β-catenin通路在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

材料與方法

一、材料

1.細(xì)胞和組織：結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116來源于江蘇省蘇北人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心。谷歌生物科技有限公司幫助構(gòu)建包含sFRP2蛋白全長的pcDNA3.1質(zhì)粒。結(jié)直腸組織標(biāo)本來源于江蘇省蘇北人民醫(yī)院2015～2017年手術(shù)切除或內(nèi)鏡活檢確診的標(biāo)本，正常結(jié)直腸黏膜標(biāo)本32例（非結(jié)直腸癌患者），結(jié)直腸癌標(biāo)本32例，共64例，所有結(jié)直腸癌患者術(shù)前均未行放化療，臨床病理特征詳見表1。

2.主要試劑：兔抗人sFRP2多克隆抗體（Abcam）、兔抗人β-catenin抗體（Santa Cruz）、免疫組化試劑盒（凱基生物）、胰蛋白酶（凱基生物）、Western Blot試劑盒（凱基生物）、CCK-8試劑盒（Dojindo）、胎牛血清（杭州四季青）、DMEM培養(yǎng)基（Hyclone）、脂質(zhì)體Lipofectamine TM3000（Invitrogen）、Transwell小室（Corning Corstart）和Matrigel基質(zhì)膠（BD）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.免疫組化（SP）：選取上述結(jié)直腸組織標(biāo)本，經(jīng)福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋后切片。依次使用二甲苯常規(guī)脫蠟、酒精梯度復(fù)水和抗原修復(fù)后，根據(jù)免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。每批均設(shè)置陰性和陽性對照，陰性對照：PBS替代一抗，陽性對照：已確定的sFRP2、β-catenin表達(dá)陽性的結(jié)直腸組織。

我們根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)判定sFRP2和β-catenin的染色情況：（1）sFRP2染色結(jié)果根據(jù)染色強(qiáng)弱和細(xì)胞陽性表達(dá)率進(jìn)行綜合評(píng)分。1）染色強(qiáng)弱：0分（無染色），1分（淡黃色），2分（棕黃色），3分（棕褐色）。2）細(xì)胞的陽性表達(dá)率：0分（≤25%），1分（26%至50%），2分（51%至75%），3分（大于76%）。綜合兩者進(jìn)行評(píng)分，依據(jù)評(píng)分判定結(jié)果，陽性（＋）：兩項(xiàng)評(píng)分之和大于3；陰性（-）：兩項(xiàng)評(píng)分之和小于等于3分。（2）β-catenin：細(xì)胞出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。膜正常表達(dá)：細(xì)胞膜染色程度大于70%；膜表達(dá)缺失：小于等于70%；胞漿或胞核陽性表達(dá)：胞漿或胞核陽性率在同類細(xì)胞中比例大于10%，兩者都稱為異位表達(dá)。異位表達(dá)和膜表達(dá)缺失統(tǒng)稱異常表達(dá)［4］。

表1 sFRP2和β-catenin與結(jié)直腸癌臨床特點(diǎn)的關(guān)系（例）

2.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方法：培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基＋培養(yǎng)箱（37℃和5%CO2）。使用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑在細(xì)胞對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)分為3組：（1）對照組：未轉(zhuǎn)染。（2）空載質(zhì)粒組：轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒。（3）sFRP2轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染過程依據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。

3.Western blot：細(xì)胞經(jīng)過處理后，加入RIPA裂解緩沖液。首先使用SDS/PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)樣品，將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，配備5%脫脂奶粉封閉液，將PVDF膜上浸泡1 h，依次與兔抗人sFRP2多克隆抗體（1:1000）和兔二抗（1:1000）反應(yīng)，后進(jìn)行曝光顯影。

4.CCK-8實(shí)驗(yàn)：將1.0×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，根據(jù)CCK-8試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。簡而言之，向每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8溶液，并將它們孵育1 h，然后在450 nm下測量吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

5.劃痕實(shí)驗(yàn)：將HCT116細(xì)胞接種于6孔板中，融合至80%～90%時(shí)，在孔板中心軸處用槍頭沿直線輕輕劃痕，然后用PBS除去細(xì)胞碎片。無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，在0 h、48 h進(jìn)行觀察拍照。測量劃痕間的距離，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6.Transwell實(shí)驗(yàn)：Transwell小室底部膜由Matrigel基質(zhì)膠包被（濾膜孔徑為8 μm）。上室：無血清DMEM培養(yǎng)基（含細(xì)胞），下室：10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，孵育24 h。除去上室細(xì)胞后，用多聚甲醛中固定15 min，染色20 min。隨機(jī)選取5個(gè)視野（100倍）進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取其平均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。t檢驗(yàn)應(yīng)用于計(jì)量資料，χ2檢驗(yàn)或Fisher精準(zhǔn)檢驗(yàn)應(yīng)用于計(jì)數(shù)資料，Spearman分析用于檢驗(yàn)相關(guān)性。組間比較選用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、免疫組化

1.sFRP2和β-catenin在結(jié)直腸組織中的表達(dá)：我們分別對正常結(jié)直腸黏膜組織和癌組織兩組進(jìn)行了免疫組化檢測，正常結(jié)直腸黏膜組織中sFRP2主要在細(xì)胞質(zhì)里表達(dá)（圖1A），β-catenin主要在細(xì)胞膜上表達(dá)（圖1C）。結(jié)直腸癌組織中sFRP2低表達(dá)或不表達(dá)（圖1B）。而β-catenin異常表達(dá)增加（圖1D）。兩組在sFRP2的陽性率、β-catenin膜表達(dá)缺失率及異位表達(dá)率等方面表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），正常黏膜組織中sFRP2的陽性率顯著高于結(jié)直腸癌組，結(jié)直腸癌組中β-catenin膜表達(dá)缺失率和異位表達(dá)率癌顯著高于正常結(jié)直腸黏膜組。詳見表2。

2.sFRP2和β-catenin與結(jié)直腸癌臨床特點(diǎn)的關(guān)系：如表1所示，sFRP2陽性表達(dá)、β-catenin膜表達(dá)缺失、異位表達(dá)與腫瘤組織分化存在明顯差異（χ2=5.420，P=0.020；χ2=6.472，P=0.011；χ2=7.158，P=0.007），而與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＞0.05）。

3. 相關(guān)性分析：通過Spearman分析，我們研究發(fā)現(xiàn)sFRP2表達(dá)分別與β-catenin膜表達(dá)缺失（r=-0.39，P=0.03）及β-catenin異位表達(dá)（r=-0.47，P=0.01）負(fù)相關(guān)，β-catenin異位表達(dá)與β-catenin膜表達(dá)缺失正相關(guān)（r=0.50，P=0.004），且相關(guān)性均顯著。詳見表3。

二、Western blot檢測

Western blot結(jié)果驗(yàn)證了轉(zhuǎn)染后sFRP2的表達(dá)水平顯著高于轉(zhuǎn)染前（t=25.430，P=0.001），β-catenin表 達(dá) 水 平 亦 較 前 提 高（t=15.000，P=0.001），β-actin作為內(nèi)參。如圖2所示。

三、CCK-8實(shí)驗(yàn)

通過CCK-8方法檢測發(fā)現(xiàn)，sFRP2轉(zhuǎn)染組分別與對照組和空載質(zhì)粒組比較［12 h：（t=0.016,P=0.988）和（t=0.041，P=0.970），24 h：（t=0.155,P=0.884）和（t=0.452，P=0.675），36 h：（t=0.695,P=0.525）和（t=1.173，P=0.306），48 h：（t=1.254,P=0.278）和（t=1.693，P=0.166），60 h：（t=3.440,P=0.026）和（t=3.576，P=0.023）］，細(xì)胞增殖速度明顯減慢（圖3），說明sFRP2抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116的增殖。

四、劃痕實(shí)驗(yàn)

通過比較sFRP2轉(zhuǎn)染組、空載質(zhì)粒組和對照組三組HCT116細(xì)胞劃痕兩側(cè)直線間的距離，來判斷sFRP2對HCT116細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：sFRP2轉(zhuǎn)染組劃痕兩側(cè)距離與空白組、空載質(zhì)粒組比較，遷移速度明顯較慢［（t=16.890，P=0.001）和（t=7.206，P=0.002）］，表明sFRP2抑制了癌細(xì)胞的遷移。如圖4所示。

五、Transwell實(shí)驗(yàn)

通過Transwell實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，對照組透膜（195.39±8.68）個(gè)，sFRP2轉(zhuǎn)染組透膜（75.69±7.19）個(gè)，對照組透膜細(xì)胞數(shù)明顯多于sFRP2轉(zhuǎn)染組（t=25.459，P=0.001），如圖5所示。

討 論

圖1 sFRP2和β-catenin在結(jié)直腸組織中的的表達(dá)。1A：正常結(jié)腸組織（sFRP2）；1B：結(jié)直腸癌組（sFRP2）；1C：正常結(jié)腸組織（β-catenin）；1D：結(jié)直腸癌組（β-catenin）（免疫組化SP法×400）

表2 sFRP2及β-catenin在兩組中的表達(dá)情況［例（%）］

表3 結(jié)直腸癌中sFRP2和β-catenin表達(dá)的相關(guān)性（例）

圖2 轉(zhuǎn)染前后HCT116細(xì)胞中sFRP2、β-catenin的表達(dá)（sFRP2及β-catenin轉(zhuǎn)染前后相比*P＜0.05）

sFRP2是sFRP家族7個(gè)成員之一，結(jié)構(gòu)上與卷曲蛋白相似，均含有半胱氨酸富集區(qū)（cysteine rich domain，CRD）。一方面，sFRP2通過CRD與Frizzed競爭結(jié)合到Wnt蛋白上抑制Wnt通路；另一方面，sFRP2與Frizzed結(jié)合生成無功能的復(fù)合物，封閉Wnt信號(hào)通路［5］，從而抑制腫瘤的發(fā)生。當(dāng)sFRP2表達(dá)減少時(shí)，與Wnt蛋白競爭性結(jié)合減少，不能阻斷或封閉Wnt通路，導(dǎo)致Wnt通路激活，便起到了促癌的作用［6-7］。我們研究發(fā)現(xiàn)sFRP2在正常結(jié)直腸黏膜組中的陽性表達(dá)率（100%）顯著大于結(jié)直腸癌組（28.1%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這與劉寧等［8］研究結(jié)果相一致。有研究報(bào)道結(jié)直腸癌中sFRP2甲基化，可導(dǎo)致sFRP2表達(dá)水平下降或沉默［9-11］。

圖3 sFRP2對結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞生長曲線的影響（sFRP2轉(zhuǎn)染組與對照組相比*P＜0.05）

圖4 sFRP2對結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116細(xì)胞遷移能力的影響（sFRP2轉(zhuǎn)染組與對照組相比*P＜0.05）

Wnt是分泌型、脂質(zhì)修飾的糖蛋白，其在胚胎發(fā)育過程中具有許多關(guān)鍵作用，并促進(jìn)成年人的組織平衡。它們可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、遷移、存活和干細(xì)胞自我更新［12-14］。異常Wnt信號(hào)與許多疾病相關(guān)，特別是癌癥［15］。Wnt/β-catenin通路是目前結(jié)直腸癌發(fā)生進(jìn)展機(jī)制研究的熱點(diǎn)［16］，當(dāng)Wnt通路激活時(shí)，β-catenin不被降解，進(jìn)入細(xì)胞核并積聚，β-catenin出現(xiàn)膜表達(dá)缺失和異位表達(dá)，與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，調(diào)控基因表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［17］。我們研究發(fā)現(xiàn)：β-catenin膜表達(dá)缺失率在結(jié)直腸癌組（53.7%）顯著大于正常結(jié)直腸黏膜（0%），β-catenin異位表達(dá)率在結(jié)直腸癌組（61.1%）顯著大于正常結(jié)直腸黏膜（0%），且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這與相關(guān)研究［8］結(jié)果相一致。

圖5 sFRP2對結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116細(xì)胞侵襲能力的影響（sFRP2轉(zhuǎn)染組與對照組相比*P＜0.05）

本研究發(fā)現(xiàn)sFRP2的表達(dá)和β-catenin異常表達(dá)均與組織分化明顯相關(guān)（P＜0.05），而與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＞0.05），這與相關(guān)研究［8，18-19］結(jié)果相一致。我們通過檢測發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)sFRP2的陽性率與β-catenin的膜表達(dá)缺失率及異位表達(dá)率均呈負(fù)相關(guān)，β-catenin的膜表達(dá)缺失率和異位表達(dá)率呈正相關(guān)，與劉寧等［8］和潘世杰［20］相關(guān)研究報(bào)道一致。主要因?yàn)閟FRP2的表達(dá)減少，導(dǎo)致Wnt通路激活，從而引起β-catenin表達(dá)的變化。

目前，在結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116中轉(zhuǎn)染上調(diào)sFRP2后研究其對細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的研究尚缺乏。我們研究發(fā)現(xiàn)sFRP2上調(diào)后細(xì)胞增殖速度顯著減慢，抑制HCT116細(xì)胞的增殖。肖燦［21］通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)人舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113細(xì)胞中sFRP2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)sFRP2的過表達(dá)顯著抑制了細(xì)胞的增殖。sFRP2表達(dá)水平下降導(dǎo)致Wnt/β-catenin通路的激活，進(jìn)而β-catenin進(jìn)入胞漿和胞核并積累，與CyclinD1啟動(dòng)子中的LEF-1位點(diǎn)相互作用，激活轉(zhuǎn)錄過程，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）被激活后，誘導(dǎo)磷酸化，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，促使細(xì)胞完成由G1期到S期的轉(zhuǎn)換，并進(jìn)入增殖期［22-23］。所以sFRP2表達(dá)水平升高阻斷或封閉Wnt/β-catenin通路，則抑制了細(xì)胞的增殖［24］。通過劃痕實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)sFRP2抑制了細(xì)胞的遷移能力。通過Transwell實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)sFRP2轉(zhuǎn)染組透膜細(xì)胞數(shù)明顯小于對照組透膜細(xì)胞數(shù)，說明sFRP2抑制HCT116細(xì)胞的侵襲能力。但是我們的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞比較單一，僅一種結(jié)直腸癌細(xì)胞，仍需要進(jìn)一步在其他結(jié)直腸癌細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，sFRP2是一種抑癌基因，通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路而發(fā)揮其作用。sFRP2結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116中轉(zhuǎn)染上調(diào)后，明顯抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。希望本研究能為結(jié)直腸癌的治療提供新的靶點(diǎn)和思路。