哮喘兒童骨膜蛋白與氣道高反應性的相關性研究

梁小輝，孟戰備，鄭紅玲

（洛陽市婦女兒童醫療保健中心，河南 洛陽 471000）

哮喘是一種以氣流阻塞為特征的復雜性臨床綜合征，與氣道高反應性（airway hyperresponsiveness,AHR）和細胞炎癥有關[1-2]。血清標志物在哮喘的診斷中具有重要的意義，并可鑒定哮喘表型。WoodruffPG等[3]利用骨膜蛋白作為Th2誘導氣道炎癥的生物標志物，對氣道上皮細胞的基因表達譜進行研究，結果顯示白細胞介素-13的響應基因POSTN（該基因可以編碼骨膜蛋白）的表達水平可將哮喘患者分為高Th2表型和低Th2表型，前者對吸入性皮質激素（ICS）反應良好，但后者不敏感。另有研究顯示白細胞介素-13單克隆抗體可改善肺功能，尤其是對血清骨膜蛋白水平很高的患者[4]。生物標志物分析表明，奧馬珠單抗可顯著降低高骨膜蛋白水平哮喘患者的發作頻率，其機制與呼出氣一氧化氮（FENO）分數及血液中嗜酸性粒細胞水平相關[5]。因此，血清中骨膜蛋白是Th2誘導氣道炎癥、嗜酸性氣道早期炎癥和Th2靶向治療反應的最理想生物標志物[6]。氣道對外源性刺激的AHR是哮喘的重要特征[7]，既往研究表明Th2型細胞因子白細胞介素-13可刺激肺成纖維細胞和氣道上皮細胞產生骨膜蛋白[3]。盡管具體作用機制尚無完全闡明，本文推測哮喘患者中，骨膜蛋白涉及哮喘氣道炎癥和氣道高反應性機制的調控。本研究探討哮喘兒童骨膜蛋白與AHR的相關性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年12月—2016年6月本中心收治的哮喘兒童60例為哮喘組，根據《全球哮喘倡議》指南[8]，其中輕度間歇性哮喘16例，輕度持續性哮喘21例，中度哮喘23例。另外選擇健康兒童30例為對照組。納入標準：符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[9]中兒童支氣管哮喘診斷標準。排除標準：在過去6個月中出現哮喘急性發作且需全身糖皮質激素控制者，在研究前4周胸片顯示有明顯的肺部疾病者。本研究經倫理委員會批準通過，研究對象及監護人均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 研究設計本研究分為4個階段：①準備階段，試驗期間所有患者均要求停止使用控制藥物；②第1次隨訪，采集兩組血液標本，并測量呼出一氧化氮水平，進行皮膚點刺試驗和肺、支氣管的呼吸量測定；③第2次隨訪，對患者進行乙酰甲膽堿和吸入甘露醇支氣管激發試驗；④第3次隨訪，內容同第2次隨訪。兩次隨訪之間間隔至少1周。血清中骨膜蛋白水平測定之前，血標本-80℃保存。

1.2.2 甘露醇支氣管激發試驗記錄兩組吸入甘露醇干粉的一秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，FEV1），作為基線值。當出現基線狀態下FEV1變化值≥15%時，被認為結果陽性，即完成了甘露醇支氣管激發試驗，或者當出現最大累積劑量甘露醇（635 mg）也被認為完成了甘露醇支氣管激發試驗，其余為陰性結果。針對甘露醇支氣管激發試驗陽性試驗結果，引起FEV1變化值≥15%的累計激發劑量（PD15劑量水平）是通過最后兩個數據點的對數線性插值計算出來的。甘露醇相應的數值即PD15值。

1.2.3 乙酰甲膽堿激發試驗受試者以日本產Chest Hl-501型肺功能儀測FEV13 次（相差＜5%），取平均值作為基線。取坐位、夾鼻，以Wright霧化器[美國產DEVILBISSAP-50空氣壓縮機驅動，霧化量恒定在（0.13±0.02）mL/min，霧化顆粒直徑1.0～ 3.0 μ]，潮氣呼吸法吸入生理鹽水2 min后測FEV13次并與基礎值比較降低均不到10%，然后從低濃度開始順次吸入各濃度的乙酰甲膽堿溶液(濃度為0.03～128 mg/mL,成倍遞增)，每一濃度吸入2分鐘，于吸入后第30 s、90 s各測FEV1，間隔5 min吸下一濃度，直至FEV1下降20%以上或最高濃度為止。以引起FEV1下降20%的乙酰甲膽堿濃度表示氣道反應性（即PC20值）的高低。

1.2.4 呼出一氧化氮水平測定采用便攜式一氧化氮分析儀測量呼出一氧化氮，該分析儀可以提供以每十億分之一為度量單位的50 mL/s呼氣流速的測量。根據美國胸科協會的指導方針，用該裝置測定的結果在臨床上可接受，與固定分析儀提供的測量結果一致。

1.2.5 血清生物標志物的測量兩組采集空腹肘靜脈血5 mL，采用酶聯免疫吸附試驗測量骨膜蛋白水平。

1.3 觀察指標

觀察并記錄兩組一般資料、外周血標志物水平，包括骨膜蛋白、總免疫球蛋白（Ig）E水平、嗜酸性粒細胞計數、嗜酸性粒細胞陽離子蛋白和呼出一氧化氮；采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）評價血清骨膜蛋白水平的診斷價值。

1.4 統計學分析

應用SPSS 21.0軟件分析數據，正態分布的計量資料以“±s”表示，采用t檢驗；非正態分布的計量資料以中位數（四分位間距）[M（Q1，Q3）]表示，采用秩和檢驗；計數資料以百分數（%）表示，采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman法；應用ROC曲線分析血漿骨膜蛋白診斷哮喘的效能。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較

兩組年齡、性別、體質量指數（BMI）、用力肺活量（forced vital capacity，FVC）等資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。60名哮喘兒童中，乙酰甲膽堿支氣管激發試驗（BPT）結果全部為陽性，甘露醇支氣管激發試驗陽性40例，陰性20例。哮喘組FEV1、FEV1/FVC顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；哮喘組使用支氣管擴張劑FEV1變化量大于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 兩組血清標志物比較

哮喘組骨膜蛋白、總IgE水平、嗜酸性粒細胞計數、嗜酸性粒細胞陽離子蛋白水平和呼出一氧化氮值高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 血清骨膜蛋白水平診斷哮喘的ROC曲線

ROC曲線結果顯示，當血清骨膜蛋白為90 ng/mL作為最佳截斷值，其診斷哮喘的AUC為0.65（95CI：0.50～0.75，P＜0.05），靈敏度為30%，特異度為95%，陽性預測值為49%，陰性預測值91%。見圖1。

2.4 檢測指標與骨膜蛋白水平的相關性分析

Spearman秩相關結果顯示，血清骨膜蛋白水平與嗜酸性粒細胞計數、呼出一氧化氮水平呈正相關（r=0.332，P=0.017；r=0.383，P=0.002），與總 IgE 水平、嗜酸性粒細胞陽離子蛋白水平、FVC1、FEV1/FVC等無線性相關（P＞0.05）。見表3。

2.5 乙酰甲膽堿和甘露醇激發試驗檢測骨膜蛋白與AHR的相關性

哮喘組血清骨膜蛋白水平與乙酰甲膽堿PC20值和甘露醇PD15值呈負相關（r=-0.293，P=0.038；r=-0.463，P=0.003）。調整了年齡、性別、遺傳性過敏癥、Log骨膜蛋白水平之后，血清骨膜蛋白水平的對數值與乙酰甲膽堿PC20對數值（生物標志物水平增加2倍，乙酰甲膽堿PC20對數值下降1.229%）、甘露醇PD15對數值（生物標志物水平增加2倍，甘露醇PD15對數值下降1.661%）顯著相關（P＜0.05）。見表4。

圖1 血清骨膜蛋白水平診斷哮喘的ROC曲線

表1 兩組一般資料比較

表2 兩組血清標志物比較

表3 檢測指標與骨膜蛋白水平的相關性分析

表4 多元線性回歸分析乙酰甲膽堿和甘露醇激發試驗檢測骨膜蛋白與AHR的相關性

3 討論

骨膜蛋白是一種分泌蛋白，在結締組織、骨、心肌、心瓣膜和皮膚中均可表達[10-11]。研究認為骨膜蛋白通過與多種整合素相互作用，可參與細胞增殖和再生、上皮-間質轉化、纖維化和血管生成[12-13]。傳統上認為哮喘是由于吸入性過敏原引起的Th2炎癥反應所致，通常是以氣道嗜酸性粒細胞浸潤為常見特征[14]。導致氣道炎癥細胞持續存在、氣道結構的改變、平滑肌功能的改變、哮喘患者AHR的機制尚不清晰。可通過采用直接刺激（如乙酰甲膽堿）或間接刺激（包括鍛煉、高滲鹽水及甘露醇）來進行支氣管激發試驗，進而評估氣道對外源性刺激的AHR。骨膜是哮喘氣道新發現的一種成分的加厚基底膜，與哮喘纖維化有關，是氣道重塑的一個特征[15-17]。

本研究結果顯示，與健康兒童比較，哮喘兒童血清骨膜蛋白水平顯著升高，與文獻[3,18,19]研究結論一致。本研究中血清中骨膜蛋白水平與外周細胞嗜酸性粒細胞計數、呼出一氧化氮量顯著正相關，與文獻[20]報道相符。用乙酰甲膽堿導致支氣管收縮和甘露醇所致的特征不同，甘露醇試驗通過1個或多個中間機制觸發氣道平滑肌收縮，如介質，包括白三烯，前列腺素，組胺和炎性細胞，引起氣道炎癥；而乙酰膽堿直接作用于呼吸道平滑肌受體，不會引起炎癥的觸發收縮[21]。與乙酰膽堿試驗相比，甘露醇試驗用來識別當前哮喘癥狀時，特異度更高，此外，甘露醇數據與氣道炎癥程度和疾病嚴重程度有較好的相關性[22-23]。本研究結果顯示，血清骨膜蛋白水平的對數值與乙酰甲膽堿PC20對數值（生物標志物水平增加2倍，乙酰甲膽堿PC20對數值下降1.229%）、甘露醇PD15對數值（生物標志物水平增加2倍，甘露醇PD15對數值下降1.661%）顯著相關。該試驗結果測量使用乙酰甲膽堿和甘露醇所致AHR。

總之，哮喘兒童血清中骨膜蛋白水平與甘露醇試驗和乙酰甲膽堿試驗引發的AHR相關，外周血細胞中骨膜蛋白水平有望作為具有臨床應用的生物標志物。然而，本研究存在以下局限性：樣本量小；無法討論研究結果與哮喘控制不佳的關系；盡管本研究結果顯示哮喘患者群體和健康群體之間骨膜蛋白水平差異顯著，但骨膜蛋白水平的ROC曲線AUC僅為0.65。骨膜蛋白與其它生物標志物聯合使用可能更有效，因此，有必要進行大型隨機臨床試驗證實。