廣州市售海產品中副溶血弧菌分離菌株的鑒定及其耐藥性分析

劉歡，謝婷，何美珊，丁楠，鐘青萍

(華南農業大學 食品學院，廣東省食品質量與安全重點實驗室，廣東 廣州，510642)

副溶血弧菌是一種常見的嗜鹽性革蘭氏陰性菌，適宜生長2.5%～3%的鹽溶液中，主要分布于海水及魚、蝦、蟹、貝等海產食品中，是引起海鮮類食物中毒的主要原因[1-3]。據報道，在亞洲，尤其是在中國、日本、韓國，因為生吃海鮮而引起的副溶血弧菌食物中毒事件頻頻發生[4-5]。2003-2005年廣東省水產品污染狀況調查顯示，431份樣品中有156份檢出副溶血性弧菌，總檢出率為36.19%[6]。2008年上海的調查數據顯示，副溶血弧菌是導致夏秋季腹瀉的主因，門診腹瀉患者肛拭檢測副溶血性弧菌陽性率為2.95%，遠高于沙門菌(0.53%)，位居首位[7]。2016年唐山市調查顯示，采集的204份海產品中，副溶血性弧菌陽性檢出率為32.84%[8]。副溶血弧菌攜帶tdh、trh毒力基因，人感染后會導致急性腸胃炎，臨床癥狀為腹瀉、頭痛、嘔吐、惡心、低燒[9]。

由于抗生素的長期、不合理使用以及缺乏有效監管，病原菌的耐藥性越來越強，且出現多重耐藥性問題。近年來，多種“超級細菌”不斷被發現，引起了國內外的廣泛關注[10]。2010年8月《柳葉刀》報道了英國卡迪夫大學醫學院蒂莫西教授發現的攜帶新德里一號金屬酶(NDM-1)基因的細菌，這是繼MRSA之后發現的又一超級耐藥細菌[11]。耐藥感染性疾病已成為當前臨床感染性疾病死亡的主要原因[12]。海產養殖過程中抗生素的濫用也導致了副溶血弧菌耐藥性的增強，使得抗生素的藥敏性大大下降甚至消失，從而導致臨床治療副溶血弧菌感染病癥難度變大，成本增加。

生物膜(biofilm)是單一或混合的微生物聚集、附著于物體表面上生長繁殖，并包被在自身分泌的胞外聚合物中而形成的類膜結構的聚合體[13-14]。生物膜能夠使細菌免受宿主的獲得性免疫應答以及吞噬細胞的捕食，使其耐藥性提高10～1 000倍[15]。本研究對廣州市售海產品中的副溶血弧菌進行分離鑒定，并分析了其耐藥性及生物膜形成能力，旨在為海產品的質量安全控制以及防治副溶血弧菌感染提供理論依據和參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標準菌株與材料

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)ATCC 17802、大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC 25922由本實驗室保藏。魚、蝦、蛤、蠔等海產品采集于廣州市區超市及農貿市場。氧化酶試紙、副溶血弧菌生化檢測試劑盒購于廣東環凱微生物科技有限公司。細菌基因組DNA提取試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 藥敏紙片

20種常用抗生素的藥敏檢測紙片，包括青霉素(PEN,10 μg)、氨芐西林(AMP,10 μg)、氨芐西林/舒巴坦(AMS,10 μg)、美羅培南(MEM,10 μg)、多粘菌素B(PB,300 μg)、萬古霉素(VAN,30 μg)、頭孢噻吩(CEP,30 μg)、頭孢他啶(CAZ,30 μg)、慶大霉素(GEN,10 μg)、卡那霉素(KAN,30 μg)、鏈霉素(STR,10 μg)、四環素(TET,30 μg)、強力霉素(DOX,30 μg)、氯霉素(CHL,30 μg)、乙酰螺旋霉素(ASP,30 μg)、紅霉素(ERY,15 μg)、環丙沙星(CIP,5 μg)、萘啶酸(NA,30 μg)、利福平(RIF,5 μg)、復方新諾明(SXT,23.75/1.25 μg)，購于杭州市微生物試劑有限公司。

1.1.3 溶液及培養基

質量濃度為1 g/L結晶紫溶液;體積分數為33%冰乙酸溶液：量取100 mL冰乙酸，加入到200 mL去離子水中。

含質量濃度為30 g/L NaCl的胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)：胰蛋白胨15 g、大豆蛋白胨5 g、NaCl 30 g、去離子水1 L。用1 mol /L NaOH 溶液調節pH 為7.0～7.4; 121 ℃，0.15 MPa下高壓滅菌15 min。

含30 g/L NaCl 的胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂培養基(TSA)：在上述TSB 配方的基礎上加入1.5% 的瓊脂，加熱融化后滅菌。

含30 g/L NaCl的堿性蛋白胨水、TCBS培養基、3%氯化鈉三糖鐵瓊脂、MR-VP培養基、MHB培養基均購于廣東環凱微生物微生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及處理

從廣州市各區的14個超市及農貿市場采集市售的魚、蝦、蛤、蠔等海產品，用無菌采樣袋裝好后放入冰盒裝中返校，確保在2 h內處理樣品。魚取表面組織、腮、腸；蝦(甲殼類)用自來水洗凈后取整個動物，包括腸和腮；蛤和蠔(貝類)用自來水沖洗干凈后取內容物。取樣時均為無菌操作方式。

1.2.2 副溶血弧菌的分離鑒定

菌株分離鑒定：按照GB 4789.7—2013中副溶血弧菌檢驗方法，樣品在質量濃度為30 g/L氯化鈉堿性蛋白胨水中增菌后，劃線分離于TCBS平板中，挑取可疑單菌落進行革蘭氏染色鏡檢、氧化酶試驗、3%氯化鈉三糖鐵瓊脂試驗、嗜鹽性試驗,并利用副溶血弧菌生化檢測試劑盒進行生化鑒定，包括30 g/L氯化鈉甘露醇、3%氯化鈉賴氨酸脫羧酶、ONPG和MR-VP試驗。

16S rDNA測序：生化試驗陽性菌株進行16S rDNA同源性比較分析。菌株在TSB培養液中培養過夜后，用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，于-20 ℃中保存備用?；蚪MDNA進行PCR擴增，所用引物為27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 和1495R： 5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。擴增體系為：無菌水10.5 μL，混合引物1 μL，taqPCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板1 μL。其中混合引物為1 μL 27f、1 μL 1492r和8 μL無菌水。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min(95 ℃變性1 min，54 ℃復性1 min，72 ℃延伸2 min)，30個循環，72 ℃保溫10 min。擴增后的DNA經檢驗送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序。將16S rDNA 基因測序結果通過BLAST在GenBank中進行同源比對分析。

1.2.3 菌株的耐藥性分析

將副溶血弧菌分離菌株、ATCC 17802菌株和質控菌株大腸埃希菌ATCC 25922分別接種于TSB和LB培養基中，于120 r/min的搖床內37 ℃活化12 h。培養液于4 000 r/min離心10 min，收集菌體，用生理鹽水10倍稀釋至濃度為108CFU/mL。

取100 μL菌液在MH瓊脂平板中，涂布均勻。干燥數分鐘后，用無菌鑷子夾取20種常用抗生素紙片輕輕放置在平板中，紙片間距不小于24 mm，距離平板邊緣不小于15 mm。平行實驗3次。將平板倒置于培養箱中，37 ℃下培養18 h后，用標準直尺測量抑菌圈大小，根據參照美國臨床實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)抗菌藥物敏感性試驗執行標準推薦的紙片擴散法及判定標準[16]、杭州微生物試劑有限公司提供的產品說明書整理出的標準(表1)判定結果。

1.2.4 結晶紫染色法測定生物膜形成量

將副溶血弧菌TSB培養液離心后收集菌體用TSB培養基10倍稀釋至濃度為106CFU/mL；分別在96孔板中每孔加入200 μL菌液；封蓋后用保鮮膜包好，在37 ℃下靜置培養24 h；將孔板中的培養液去除，使用多道移液槍在每孔中加入250 μL無菌生理鹽水清洗3遍，去除浮游菌； 60 ℃干燥15 min；在干燥后的孔板中加入200 μL質量濃度為1 g/L的結晶紫溶液，染色10 min；棄去結晶紫溶液，使用無菌生理鹽水清洗3遍，繼續干燥15 min；在每孔中加入200 μL、33%冰乙酸，靜置10 min后，使用Multiskan FC酶標儀(Thermo, USA)測量OD595值[17]。

表1 副溶血弧菌對20種抗生素的耐藥標準Table 1 Criteria for antibiotic resistance of Vibrio parahaemolyticus against 20 antibiotics

注： R為耐藥；I為中介敏感；S為敏感。a為尚未在CLSI標準和相關文獻中找到的判定標準，是本實驗室暫定的判定值。下同。

2 結果與分析

2.1 海產中副溶血弧菌的分離鑒定

從廣州市區的超市及農貿市場采集市售海產品，隨即進行樣品處理，增菌18 h后進行TCBS平板劃線分離、革蘭氏染色鏡檢、氧化酶試驗、質量濃度為30 g/L的氯化鈉三糖鐵試驗、嗜鹽性試驗。結果表明，分離菌株在TCBS培養基中菌落為綠色(圖1)，鏡檢為短弧狀的桿菌(圖2)。

圖1 副溶血弧菌在TCBS、TSA平板上的菌落形態Fig.1 Colony morphology of Vibrio parahaemolyticus on TCBS and TSA plates

圖2 副溶血弧菌分離菌株掃描電鏡圖Fig.2 SEM picture of the isolated strain of Vibrioparahaemolyticus

氧化酶試驗呈陽性，具有嗜鹽性。對8株菌株進行生理生化實驗和16S rDNA同源性比較，鑒定為副溶血弧菌菌株(表2)。

2.2 分離菌株的耐藥性分析

測定副溶血弧菌分離菌株和ATCC 17802菌株對常用20種抗生素的藥敏結果如表3、圖3所示。結果表明，8株分離菌株對青霉素類、β-內酰胺類、青霉烯類的抗生素抗性很強，對氨基糖苷類、四環素類、苯丙醇類、大環內酯類、喹諾酮類、安莎霉素類、葉酸代謝途徑抑制劑等抗生素較為敏感。其中對青霉素、萬古霉素2種抗生素均顯示耐藥性；對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢噻吩耐藥的菌株也達到7株，對美羅培南、利福平耐藥的菌株分別有6株和5株。而對多粘菌素B、頭孢他啶、慶大霉素、氯霉素、紅霉素、環丙沙星、萘啶酸等抗生素均敏感，對卡那霉素、氯霉素、四環素、強力霉素、復方新諾明具有耐藥性的菌株比較少，有1～2株，說明這些抗生素表現出對副溶血弧菌分離菌株較強的抑制作用。此外，只有8號菌株的耐藥性弱于ATCC 17802菌株，大部分分離菌株耐抗生素的種類更多。

表2 分離菌株16S rDNA同源性比對分析Table 2 16S rDNA sequence analysis of the isolated strains of Vibrio parahaemolyticus

表3 分離菌株的耐藥性測定Table 3 Drug resistances of the isolated strains ofVibrio parahaemolyticus

圖3 不同抗生素的耐藥性菌株數量分析Fig.3 The numbers of the resistant strains against different antibiotics

2.3 菌株的多重耐藥性分析

通過分析發現，所有菌株都存在多重耐藥性，且耐抗生素種類都在3～10種，多重耐藥性主要發生于青霉素類、β-內酰胺類、青霉烯類之間(圖4)。由此可見副溶血弧菌分離菌株多重耐藥性很強。同時，ATCC 17802菌株也具有多重耐藥性，耐抗生素種類為5種。其中來源于鱸魚、蝦體內的分離菌株多重耐藥性很強，2號菌株耐藥性最強，耐抗生素種類高達10種，1、4、5、7號菌株耐抗生素8種以上，均比ATCC 17802菌株多。僅有來源于蛤的8號菌株耐3種抗生素，多重耐藥性相對ATCC 17802菌株較弱。在對多重耐藥譜分析中發現，來源于蝦體內的4、5號菌株耐抗生素都是8種，且兩者只有1種抗生素差別；來源于魚的1、2、6、7號菌株的多重耐藥無論數量還是種數差異都比較大(表4)。

圖4 副溶血弧菌分離菌株的多重耐藥性分析Fig.4 Multi-drug resistances of the isolated strains of Vibrioparahaemolyticus

2.4 副溶血弧菌生物膜形成能力分析

副溶血弧菌標準菌株和8株分離菌株的生物膜形成能力如圖5所示。所有菌株都具有一定的生物膜形成能力，但生物膜形成量有一定的差異。其中1、2、3、4、5、7號菌株形成生物膜的能力比較強，尤其是1、2、3、4號菌株；6、8號菌株生物膜成膜能力較弱。僅有8號菌株的生物膜形成能力弱于標準菌株。

表4 副溶血弧菌分離菌株的多重耐藥譜Table 4 Multidrug resistance spectrum of Vibrioparahaemolyticus strains

圖5 副溶血弧菌生物膜形成能力Fig.5 The biofilm formation ability of Vibrio parahaemoly-ticus strains注：**表示與ATCC 17802菌株對比有極顯著差異(p<0.01)。*表示與ATCC 17802有顯著差異(p<0.05)，沒有標識為無顯著差異。

3 結論與討論

3.1 菌株耐藥性差異分析

副溶血弧菌耐藥性具有時空特性，不同地區的菌株具有不同的耐藥性。這是由于每個地區使用抗生素種類、劑量和菌群特異性導致的。本研究的結果表明，市售海產品中8株副溶血弧菌分離菌株對青霉素、萬古霉素2種抗生素顯示完全耐藥；對美羅培南、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢噻吩、利福平這5種抗生素具有非常普遍的耐藥性，耐藥菌株在5株以上；對卡那霉素、氯霉素、四環素、強力霉素、復方新諾明5種抗生素耐藥性很低，對多粘菌素B、頭孢他啶、慶大霉素、氯霉素、紅霉素、環丙沙星、萘啶酸等抗生素均敏感。同為廣州市海產品中副溶血弧菌分離菌株，冼鈺茵等[18]的研究表明，其對萬古霉素、氨芐西林、鏈霉素的耐藥率分別為100%、77.01%和85.06%，對利福平、慶大霉素、紅霉素、頭孢噻吩、四環素、復方新諾明、環丙沙星的耐藥率在5%及以下。這與本實驗結果具有比較高的一致性，但又在頭孢噻吩、利福平這2種抗生素上存在區別。說明同地區的副溶血弧菌耐藥性也不盡相同。而由于不同地區抗生素使用數量和劑量的差別、菌群差別，在國內的其他地區或國外地區，副溶血弧菌耐藥性差異更大。盧奕等[19]研究表明，上海市水產品中副溶血弧菌對卡那霉素、多粘菌素B、環丙沙星的耐藥性很高，對氨芐西林/舒巴坦、頭孢噻吩、萬古霉素、利福平的耐藥性非常低，這與本實驗的結果不同。

分離菌株對同一類抗生素的耐藥性不同。如萬古霉素和多粘菌素B都是糖肽類抗生素，頭孢噻吩和頭孢他啶都是頭孢類抗生素，由于前者是第一代藥物，后者是第三代藥物，副溶血弧菌對前者耐藥性明顯比后者強。不同來源的副溶血弧菌菌株的耐藥性也不同，本研究發現，來源于魚和蝦的7株菌多重耐藥性強，耐抗生素種類為5～10種。相比較而言，來源于蛤的8號菌株，多重耐藥性較弱，耐抗生素為3種。

3.2 細菌生物膜與耐藥性

細菌生物膜是細菌生存的一種重要機制，它增強了細菌對不良環境的耐受力，尤其是耐藥性。生物膜阻礙隔絕抗生素的進入，同時為膜內細胞的生存及相互交流提供穩定環境[20-21]。同時，生物膜外排泵系統[22]、特定基因變化引起的應激反應[23]、群體感應[24]、膜內細菌代謝活性下降[25]也是其耐藥機制。本研究分析副溶血弧菌藥敏實驗結果及其生物膜形成能力發現，兩者之間存在正相關。其中，1、2、3、4、5、7號菌株生物膜形成能力比較強，其多重耐藥性也非常顯著，耐抗生素種類為7～10種；6號和8號菌株生物膜形成能力比較差，耐抗生素種類分別為5種和3種。與標準菌株ATCC 17802相比，6號和8號菌株在形成生物膜能力差異相對小，其多重耐藥性的差異也不大，而其他菌株生物膜形成能力極顯著(p<0.01)強于標準菌株，其多重耐藥性也十分顯著。有研究表明生物膜細菌對次氯酸的抗性比浮游菌強15～3 000倍[26]，致病性大腸桿菌對環丙沙星及氟苯尼考的耐藥性與生物膜形成能力呈正相關[27]。

3.3 副溶血弧菌耐藥機制

副溶血弧菌作為常見的食源性致病菌，威脅著人類的健康，其耐藥性一直受到國內外專家學者的廣泛關注。已有研究表明，副溶血弧菌耐藥機制主要有：(1)可移動基因元件。質粒介導的獲得耐藥基因盒的整合子能夠在細菌間直接進行基因水平轉移。已有研究表明，副溶血弧菌存在質粒介導的Blaper-1、Blacmy-2、Blaveb-1 3種超廣譜β-內酰胺酶(ESBL)，能夠破壞抗生素，尤其是頭孢類抗生素[28-30]。(2)藥物作用靶位改變。革蘭氏陰性菌在β-內酰胺類抗生素作用下，其青霉素結合蛋白位點發生突變而導致與抗生素親和力發生改變產生耐藥性。(3)細胞膜滲透性改變。由于一些細菌細胞膜的膜孔蛋白少、通道小，導致抗生素(如β-內酰胺類)很難進入細胞內，這是細菌的“固有耐藥性[31]。(4)外排機制是細菌形成耐藥性及多重耐藥性的重要因素。副溶血弧菌的外排泵主要有Vmr A、Nor M和Vme AB，其能夠將大分子物質排出細胞外，幫助其產生多重耐藥性[31-32]。本研究通過對市售海產品中副溶血弧菌的耐藥性及其生物膜形成能力的分析，可以為后續的副溶血弧菌耐藥性的深入研究提供參考資料，也為海產品的質量安全控制、防治副溶血弧菌感染提供理論依據，具有積極的現實意義。