羅伊氏乳桿菌氮源利用的選擇性與特征分析

朱丹鳳，王園園，崔樹茂*，毛丙永，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇無錫，214122) 2(無限極(中國)有限公司，廣東廣州 510623)

羅伊氏乳桿菌屬于乳酸桿菌，革蘭氏陽性菌，無芽孢，不運動，方形桿狀，屬于專性異型發(fā)酵，生長過程中會產(chǎn)生CO2、乳酸、乙酸和乙醇等。羅伊氏乳桿菌是目前報道的可存在于所有脊椎動物和哺乳動物腸道內(nèi)的乳酸桿菌，在厭氧或非厭氧環(huán)境中都可以生長[1-2]。

羅伊氏乳桿菌是多氨基酸營養(yǎng)缺陷菌株，不能直接利用外源蛋白質(zhì)和無機(jī)氮源，必須通過降解外源蛋白質(zhì)或肽，以保證菌體正常生長代謝對氨基酸的需要。通常乳酸菌編碼相對完善的蛋白水解系統(tǒng)，主要由3部分組成[3]：細(xì)胞壁表面的蛋白水解酶，不同類型的氨基酸、二肽、三肽和寡肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，以及一些胞內(nèi)肽酶。首先由細(xì)胞壁蛋白水解酶降解外源蛋白形成寡肽和氨基酸，目前大多數(shù)研究都是乳酸菌在乳制品中的蛋白水解體系，牛乳中的胞外蛋白酶主要水解酪蛋白[4]，其他益生菌株對氮源的利用情況很少涉及，之后通過特定的肽轉(zhuǎn)運和氨基酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)運輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，寡肽通過寡肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)Opp轉(zhuǎn)運，二肽或三肽則是DtpP和DtpT，多數(shù)研究證明寡肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)Opp對于菌株利用是最重要的[5-6]。最后由胞內(nèi)各種肽酶將肽降解為更小的肽和游離氨基酸以提供給菌體生長利用[7]。但是，乳酸菌的蛋白水解系統(tǒng)具有很強(qiáng)的菌株特異性，乳酸菌為適應(yīng)各自的生長環(huán)境，在進(jìn)化過程中發(fā)生諸如點突變、重組或者重復(fù)序列變異等自身基因的變異，及基因水平轉(zhuǎn)移，通過獲得新基因來適應(yīng)環(huán)境[8]；也有一些乳酸菌因生長環(huán)境營養(yǎng)豐富，致使一些“無用”的基因不斷鈍化、衰退、缺失。因此，不同環(huán)境中的乳酸菌逐漸形成了菌株和環(huán)境特異的氮代謝系統(tǒng)，氮源的利用一直是制約乳酸菌生長的關(guān)鍵因素。羅伊氏乳桿菌138-1篩選自長壽老人腸道，通過動物實驗被證明具有降血糖的功效，具有潛在的生產(chǎn)和應(yīng)用價值。但是，該菌種能夠利用什么樣的氮源，其對氮源利用具有什么樣的特征？目前還是未知。

不同種類的氮源經(jīng)過不同的水解工藝后，會產(chǎn)生不同組成的氨基酸、寡肽和多肽。羅伊氏乳桿菌氮代謝系統(tǒng)的底物特異性決定其可能對不同氮源具有不同的利用效率。該文將系統(tǒng)探討羅伊氏乳桿菌138-1對不同種類氮源的利用效率，并進(jìn)一步分析有效利用的氮源組分，不僅可以為乳酸菌的生產(chǎn)提供氮源優(yōu)選策略，而且可以指導(dǎo)氮源生產(chǎn)企業(yè)。根據(jù)菌株對氮源種類和分子量的要求優(yōu)化水解工藝，讓所生產(chǎn)氮源更適宜菌株的增殖。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

羅伊氏乳桿菌138-1(CCFM8631)，江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心保藏。

1.1.2 試劑

葡萄糖測定試劑盒，上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；MRS培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；其余化學(xué)試劑均是分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；市售氮源見表1。

表1 試驗氮源Table 1 Sources of different nitrogen sources

1.2 儀器與設(shè)備

GRP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；FE20型pH計、EL3002型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；MS 3 basic型渦旋振蕩器，德國IKA公司；l?ser-om806m型冰點滲透壓測定儀，德國l?ser公司；T&J-Minipod 1L×8型迷你平行發(fā)酵罐，迪必爾生物工程(上海)有限公司；MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；ZHJH-C1115B型超凈工作臺，上海智誠分析儀器制造有限公司；UV-2450紫外分光光度計，日本島津公司；高效液相色譜儀Ag1100，美國安捷倫公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的活化與培養(yǎng)

從凍存的甘油保菌管內(nèi)，用接種環(huán)挑取少量菌液于MRS固體培養(yǎng)基劃線，將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。從長出的菌落中挑取單菌落，接種于5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，在恒溫37 ℃培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)18～24 h。重復(fù)上述操作1次得到活化后的種子液。

1.3.2 羅伊氏乳桿菌生長曲線的測定

將上述種子液以2%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，置于恒溫37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 h取樣，一部分樣品測定菌液的OD600值，當(dāng)吸光度值超過0.8時，將菌懸液稀釋一定倍數(shù)，使稀釋后的吸光度值在0.2～0.8，菌懸液的OD600值為測定的吸光度值乘以稀釋倍數(shù)。然后以時間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制菌株生長曲線。另一部分樣品經(jīng)離心去除菌體后，測定發(fā)酵中的葡萄糖含量和總酸含量，計算羅伊氏乳桿菌發(fā)酵過程中代謝單位葡萄糖的產(chǎn)酸量。

1.3.3 羅伊氏乳桿菌分批培養(yǎng)最高生物量測定

準(zhǔn)確稱取25 g/L上述不同氮源，替換MRS培養(yǎng)基中的所有氮源(胰酪蛋白胨、酵母粉和牛肉膏)，配制成不同氮源的培養(yǎng)基。以2%的接種量接入待實驗菌株，置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待菌株生長至穩(wěn)定期前后(6、8和10 h)，取樣測定OD600，以MRS為對照。

1.3.4 羅伊氏乳桿菌恒pH自動反饋補糖生長曲線的測定

根據(jù)1.3.3配制不同氮源的培養(yǎng)基，以相同的量置于T&J-Minipod 1L×8型迷你平行發(fā)酵罐。以5%的接種量接入待實驗菌株，通過發(fā)酵罐的控制系統(tǒng)，恒pH 6.0自動反饋補糖培養(yǎng)，確保菌體在增殖過程中不受到酸和碳源缺乏的抑制[9]。具體操作如下：

分別配制400 g/L(C堿)的NaOH溶液和400 g/L(C料)的葡萄糖溶液，并分別置于補堿瓶和補糖瓶。開啟發(fā)酵罐補糖與補堿的關(guān)聯(lián)系統(tǒng),關(guān)聯(lián)比例(k)根據(jù)以下公式設(shè)置：

式中：40表示NaOH的摩爾質(zhì)量，g/mol；W，表示菌株代謝單位質(zhì)量的葡萄糖產(chǎn)生酸的摩爾質(zhì)量，mol/g，該值由1.3.2測定得到。恒pH自動反饋補糖過程中，每2 h取樣，分別測定菌液OD600、發(fā)酵液葡萄糖含量及滲透壓，并在菌液濃度達(dá)到最高時，通過平板菌落計數(shù)法測定發(fā)酵液活菌數(shù),并保存發(fā)酵前和發(fā)酵后的發(fā)酵液，用于測定氨基酸和肽組成變化。

1.3.5 發(fā)酵液氮源組成分析

根據(jù)LIU等的方法，進(jìn)行發(fā)酵液氨基酸和肽組成的測定[10]。氨基酸測定操作如下：色譜柱為5 μm ODS HYPERSIL(250 mm×4.6 mm)，柱溫40℃，流動相A相：將8.0 g結(jié)晶乙酸鈉加入1 000 mL水?dāng)嚢枋蛊涑浞秩芙猓笤跓屑尤?25 μL三乙胺，邊攪拌邊滴加體積分?jǐn)?shù)為5%的醋酸，將pH值調(diào)到7.2±0.05；最后加5 mL四氫呋喃，混合后備用。流動相B相：將8.0 g結(jié)晶乙酸鈉加入400 mL水?dāng)嚢枋蛊涑浞秩芙猓瑯拥渭芋w積分?jǐn)?shù)為2%醋酸將pH值調(diào)到7.2±0.05；將此溶液加入至800 mL乙腈和800 mL甲醇，混合后備用。樣品前處理：取1 mL樣液(根據(jù)最終氨基酸總量對樣品進(jìn)行稀釋)，加入1 mL 100 g/L三氯乙酸(TCA)進(jìn)行1∶1稀釋，記錄稀釋倍數(shù)。室溫下放置1 h,用0.22 μm針頭式濾器過濾。濾液取1 mL轉(zhuǎn)移入1.5 mL的離心管中，離心(15 000 r/min，30 min)。取出后，移取400 μL于液相小瓶中，蓋上液相小瓶帽。

肽組成測定如下：色譜柱為TSKgel 2000 SWXL(300 mm×7.8 mm)，流動相為V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1混合溶液，流速設(shè)置為0.5 mL/min，柱溫是30 ℃，紫外檢測器的檢測波長設(shè)定為220 nm。

1.3.6 發(fā)酵液葡萄糖測定

采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法測定發(fā)酵液中的葡萄糖濃度，按照葡萄糖測定試劑盒的說明，具體操作如下：等體積混合試劑1和試劑2，分裝成1 mL的測試管，樣品管加入10 μL待測樣品，標(biāo)準(zhǔn)管加入10 μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，空白管加入10 μL蒸餾水。37 ℃水浴10 min，用空白管調(diào)零，在505 nm下測定樣品管和標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度，通過以下公式計算得到葡萄糖的濃度：

1.3.7 發(fā)酵液滲透壓測定

發(fā)酵液離心后取100 μL用滲透壓測定儀直接測定。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗中每個實驗值的測定均為3次平行實驗的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅伊氏乳桿菌生長曲線

按照1.3.2所述方法，對羅伊氏乳桿菌138-1進(jìn)行生長曲線的測定。從0 h開始，每2 h測1次OD600，直至菌體不再生長為止，繪制的生長曲線如下圖1。0～2 h為延滯期，菌體生長緩慢；2～8 h為指數(shù)生長期，菌體快速生長繁殖；8～12 h為穩(wěn)定期，菌體生長量達(dá)到最大，并且基本保持恒定；12 h之后菌體進(jìn)入衰亡期。

圖1 羅伊氏乳桿菌138-1的生長曲線Fig.1 Growth curve of Lactobacillus reuteri 138-1

2.2 羅伊氏乳桿菌利用不同氮源初步分析

以不同氮源發(fā)酵液分批培養(yǎng)羅伊氏乳桿菌138-1，根據(jù)生長過程的最高生物量初步分析其對21種不同氮源的利用效率，結(jié)果如表2所示。

表2 不同氮源發(fā)酵液分批羅伊氏乳桿菌138-1的最高生物量Table 2 Effects of Lactobacillus reuteri 138-1 on theproliferation of different nitrogen sources

羅伊氏乳桿菌138-1對酵母提取物、酵母蛋白103、酵母浸粉528、酵母浸粉803具有最高的利用效率，其次是胰蛋白胨，對其他種類的氮源利用效果較差，或者基本不利用氮源。表明羅伊氏乳桿菌對不同種類的氮源具有偏好性，同時也發(fā)現(xiàn)同一類別氮源對菌株的增殖效果有差異。可能是同一類別的氮源經(jīng)不同的水解工藝，產(chǎn)生的氨基酸和多肽組成不同，也說明了菌株可利用的氮源相對分子質(zhì)量可能具有偏好性。

在分批培養(yǎng)過程中，發(fā)酵液pH值的降低會抑制菌體的生長，即氮源還未被利用完全，菌株即因酸積累停止生長。4種酵母類氮源、胰蛋白胨氮源培養(yǎng)基與對照MRS培養(yǎng)基分批培養(yǎng)羅伊氏乳桿菌最高生物量沒有顯著差異，可能是因為不同氮源的可被有效利用的成分含量不同，也可能是因為不同氮源的緩沖能力不同。因此需要通過恒pH 6.0(解除酸抑制)并補糖(自動反饋補料補充碳源)的培養(yǎng)方式，進(jìn)一步分析上述氮源對羅伊氏乳桿菌的增殖效率。

2.3 羅伊氏乳桿菌氮源利用的選擇性分析

采用恒pH自動反饋補糖培養(yǎng)羅伊氏乳桿菌138-1進(jìn)一步分析其利用4種酵母類氮源和胰蛋白胨的增殖效率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 羅伊氏乳桿菌138-1利用不同氮源恒pH補糖培養(yǎng)生長曲線Fig.2 The growth curve of Lactobacillus reuteri 138-1 using different nitrogen sources with constant pH and automatic feedback feeding culture

羅伊氏乳桿菌138-1利用酵母類氮源的生長速率和最大生物量顯著高于胰蛋白胨和MRS培養(yǎng)基，其中利用酵母蛋白528和酵母提取物生長的最大生物量最高，OD600分別達(dá)到13.10±0.32和13.40±0.13，是胰蛋白胨和MRS培養(yǎng)基的3倍左右。但是，該結(jié)果不能充分說明羅伊氏乳桿菌138-1對酵母提取物和酵母浸粉528的選擇性最好，菌株生長至最大生物量時也會受到發(fā)酵體系底物濃度、滲透壓和生長因子的影響。

通過連續(xù)測定發(fā)酵過程中發(fā)酵液的葡萄糖質(zhì)量濃度(圖3)，發(fā)現(xiàn)菌株利用不同氮源發(fā)酵過程中葡萄糖含量在一定范圍內(nèi)變化，但均沒有出現(xiàn)過高或過低的情況。表明自動反饋補糖培養(yǎng)方式可以根據(jù)菌體生長過程中對糖的需求自動補糖，使糖含量保持在一個穩(wěn)定的范圍，證實了該培養(yǎng)方式的可靠性，也排除了糖含量不足對菌體生長的影響。通過測定各氮源發(fā)酵培養(yǎng)基在菌株停止生長時的滲透壓，發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌138-1利用酵母浸粉528生長至最高生物量時，發(fā)酵液的滲透壓最高，達(dá)到(1 618±15) mOsm/kg。根據(jù)菌株的耐滲透壓實驗，發(fā)現(xiàn)直至MRS培養(yǎng)基添加NaCl濃度為36 g/L(約為1 600 mOsm/kg)，羅伊氏乳桿菌138-1依然可以生長，排除滲透壓的影響，證實各氮源培養(yǎng)基中菌株停止生長不是因為滲透壓的影響。

圖3 恒pH自動反饋補糖培養(yǎng)羅伊氏乳桿菌138-1生長過程發(fā)酵液糖含量的變化Fig.3 Changes of glucose content in fermentation broth of Lactobacillus reuteri 138-1 during constant pH and automatic feedback feeding culture

眾所周知，生長因子是菌株生長必不可少的微量物質(zhì)，但微生物本身卻不可以合成，如果菌株生長缺乏生長因子的話，蛋白水解系統(tǒng)中的酶系表達(dá)會受影響，進(jìn)而嚴(yán)重影響其代謝增殖水平。酵母提取物等氮源通常被認(rèn)為是富含生長因子的氮源，其對羅伊氏乳桿菌138-1的增殖效率高可能是因為其富含生長因子的原因。為了探究菌株增殖濃度的不同是否是受生長因子缺乏的影響，將增殖效果差的氮源與可能含生長因子的酵母類氮源1∶1復(fù)合分析其對實驗菌株的增殖效率的影響(圖4)。如果增殖效果差的氮源確是因為氮源缺乏生長因子所致，且酵母類氮源富含生長因子，則兩者氮源復(fù)合后，生長因子會促進(jìn)實驗菌株對效果差的氮源的利用，菌株利用復(fù)合氮源的最大生物量會與利用酵母類氮源相同，甚至更高；如果菌株利用各氮源的差異不是由于生長因子的缺乏所致，導(dǎo)致兩者復(fù)合后，菌株利用復(fù)合氮源的最大生物量是利用各自氮源的最大生物量的一半相加之和。

圖4 恒pH自動反饋補糖培養(yǎng)羅伊氏乳桿菌138-1利用復(fù)合氮源的生長曲線Fig.4 Growth curve of Lactobacillus reuteri 138 - 1 with compound nitrogen sources during constant pH and automatic feedback feeding culture

通過恒pH自動反饋補糖培養(yǎng)羅伊氏乳桿菌138-1利用酵母浸粉528與其他氮源復(fù)合的增殖效率，結(jié)果顯示，復(fù)合氮源并沒有提高菌株的生長速率及最大生物量。說明增殖效果差的氮源不是由于缺乏生長因子，而是本身可被羅伊氏乳桿菌138-1利用的有效氮源含量少導(dǎo)致。

2.4 羅伊氏乳桿菌對氮源利用的特征

通過羅伊氏乳桿菌138-1對不同氮源的選擇性分析，證實各氮源被利用的差異，是因為各氮源中被羅伊氏乳桿菌有效利用的氮源成分含量不同所致，通過分析各氮源的多肽組成(如表3)，發(fā)現(xiàn)每種氮源的肽分子質(zhì)量分布雖有差異，但分子量小于2 000 Da的多肽含量均豐富，最顯著的差異是酵母類氮源中氨基酸含量高。但是，以酵母浸粉528氮源研究氨基酸對羅伊氏乳桿菌138-1的影響，發(fā)現(xiàn)菌株發(fā)酵前后，氨基酸的種類和含量并沒有顯著降低，其他氮源的氨基酸種類和含量也很豐富(文中未列出)，說明氨基酸并不是限制其生長的因素。

表3 不同氮源發(fā)酵前后HPLC分析Table 3 Fermentation before and after of HPLC analysis with different nitrogen sources

PICON等[3]發(fā)現(xiàn)，24株乳球菌中，有18株菌株含有Opp和Dpp，肽酶的活力是最高的。杜越歐等[6]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌主要利用氮源中的多肽，在未添加和添加了多肽的培養(yǎng)基中，乳酸菌的關(guān)鍵酶基因表達(dá)有顯著差異，說明肽含量是乳酸菌生長的一個限制因素。通過分析發(fā)酵前后各氮源多肽的變化，發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌主要利用分子質(zhì)量在1 000 Da以下的肽，且對500 Da以下的小分子肽利用率最高。1分子氨基酸平均分子質(zhì)量為120 Da左右，即羅伊氏乳桿菌138-1僅能利用二肽～五肽的小分子肽，大分子肽及蛋白質(zhì)無法利用，且利用的肽的種類主要來自于酵母類蛋白的水解產(chǎn)物，對其他蛋白水解得到的肽利用很少。酵母類氮源中含有大量的小分子肽，小分子肽通過特定的肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)運輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，進(jìn)一步由胞內(nèi)各種肽酶降解為更小的肽和游離氨基酸以提供菌體生長利用。一些氨基酸生物合成能力較差的菌株，只能通過編碼更豐富的肽酶和肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)來滿足自身生長的需要[11-12]。羅伊氏乳桿菌不能很好地利用大分子蛋白，可能與其不能合成細(xì)胞壁蛋白水解酶有關(guān)[13]，只有小分子肽才被利用。而且不同蛋白所含的小分子肽即使分子質(zhì)量相近，但由于肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的底物特異性[14-15]，導(dǎo)致來源不同的氮源即使分子質(zhì)量相同，乳酸菌也不能利用。LIU等[16]對乳酸菌蛋白水解體系在不同菌種之間的差異性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同菌種甚至菌株之間蛋白水解體系都有明顯的差異。因此對于上述的復(fù)合氮源結(jié)果也是吻合的，由于添加了酵母類氮源，羅伊氏乳桿菌利用其可利用的肽類，其他種類的氮源仍然不被利用，與是否缺乏生長因子沒有關(guān)系。

圖5 羅伊氏乳桿菌138-1酵母浸粉528發(fā)酵前后游離氨基酸變化Fig.5 Comparison of free amino acid composition of Lactobacillus reuteri 138-1 with yeast extract 528 fermentation before and after

3 結(jié)論

(1)羅伊氏乳桿菌138-1對于不同種類的氮源具有偏好性，主要利用酵母類氮源，也可利用胰蛋白胨。對其他種類的氮源如植物類氮源(大豆蛋白胨、水解植物蛋白等)和動物類氮源(魚骨蛋白胨、牛肉蛋白胨、牛骨蛋白胨等)利用效果較差或基本不利用。

(2)通過恒pH自動反饋補糖培養(yǎng)羅伊氏乳桿菌138-1，酵母浸粉528和酵母提取物的增殖效率最高，最大生物量分別達(dá)到13.10±0.32和13.40±0.13，是MRS的3倍左右。

(3)羅伊氏乳桿菌138-1氮源利用的選擇性歸因于氮源本身可被菌株有效利用的氮源含量，與生長因子無關(guān)。

(4)添加了酵母浸粉528的培養(yǎng)基，發(fā)酵前后游離氨基酸都是充足的，證明氨基酸不是羅伊氏乳桿菌的限制性底物，肽含量可能是菌株的生長限制性底物。而且發(fā)酵前不同種類氮源肽含量均豐富，但是菌株利用卻有差異性。酵母類氮源原料是酵母蛋白，整體的分子質(zhì)量都集中在500 Da以下；乳基蛋白原料是水解酪蛋白，動物類蛋白和植物類蛋白原料都是大分子的組織蛋白，可以看出羅伊氏乳桿菌可能對氮源種類具有偏好性。

(5)羅伊氏乳桿菌138-1對于同一種類的氮源也具有偏好性。雖然羅伊氏乳桿菌對微生物類氮源具有偏好性，但是當(dāng)1 000 Da氮源肽段含量豐富時，菌株的比生長速率和最高生物量都會顯著升高，尤其是180～500 Da利用率最高。本實驗結(jié)果對于工業(yè)上羅伊氏乳桿菌的增殖具有極其重要的指導(dǎo)意義，同時可以結(jié)合蛋白水解技術(shù)，將廉價的蛋白原料經(jīng)過蛋白酶水解，使其水解底物的肽段集中在180～500 Da，可以直接用于羅伊氏乳桿菌的增殖培養(yǎng)。對于不同的氮源，也可以直接推斷出羅伊氏乳桿菌的增殖效果，此舉減少了大量的人力物力，對未來羅伊氏乳桿菌的利用起到了很大的推動作用，不僅僅是羅伊氏乳桿菌，其他的乳酸菌也是可以同樣找到規(guī)律。