一種黑曲霉高耐熱β-葡聚糖酶基因的克隆、表達(dá)及重組酶性質(zhì)分析

韓冰,王施嵐,德青美朵,沈微,陳獻(xiàn)忠,樊游

(江南大學(xué),工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

β-葡聚糖是大麥、高粱等農(nóng)作物胚乳細(xì)胞壁的重要成分，是一種具有高粘度的生物大分子。β-葡聚糖酶主要通過對β-葡聚糖的降解以降低底物黏度，在啤酒和飼料工業(yè)中有重要的應(yīng)用價值。目前，我國葡聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)菌種主要是里氏木霉(Trichodermareesei)[1]，其所產(chǎn)β-葡聚糖酶的最適溫度在60 ℃左右，最適pH在4.8～5.5。黑曲霉(Aspergillusniger)和淀粉液化芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)來源的葡聚糖酶也有一定的應(yīng)用，前者最適pH在4.0～6.0，最適溫度一般在50～60 ℃[2]；后者最適pH在6.0左右，最適溫度為50 ℃[3]。這些工業(yè)化生產(chǎn)菌種具有較高的發(fā)酵水平，但產(chǎn)品在耐熱性和耐酸性方面還不能充分滿足啤酒和飼料工業(yè)的需要[4]。在啤酒釀造中，葡聚糖酶主要在糖化工段中使用，麥汁糖化過程的溫度有時可以達(dá)到65～70 ℃[4]。在飼料加工中，雖然β-葡聚糖酶在37 ℃左右的中性環(huán)境發(fā)揮作用，但在此之前其必須要耐受飼料生產(chǎn)過程中造粒工段的高溫環(huán)境和動物胃部的酸性環(huán)境。飼料造粒工段的溫度一般要達(dá)到75～85 ℃，甚至更高，而成年動物胃部pH一般在2～3。因此耐酸和耐熱依然是開發(fā)飼料用β-葡聚糖酶的重要目標(biāo)。自然界中許多微生物可以產(chǎn)生內(nèi)切葡聚糖酶，其中相當(dāng)一部分已實現(xiàn)了異源表達(dá)[5]。在這些葡聚糖酶中，細(xì)菌來源的葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性普遍低于真菌，而且最適pH值普遍中性[5]。絲狀真菌來源的葡聚糖酶大多有一定的耐酸性[4-11]，這可能是其在應(yīng)用上的一個優(yōu)勢。嗜熱真菌來源的葡聚糖酶在耐酸性和耐熱性方面均有一定的優(yōu)勢，因此受到研究者的關(guān)注。嗜熱真菌Talaromycesemersonii來源的葡聚糖酶基因在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)產(chǎn)物的最適溫度高達(dá)90 ℃，最適pH 4.5，在80 ℃下酶活半衰期大約為50 m[12]，可能是目前已發(fā)現(xiàn)的耐熱性最高的真菌葡聚糖酶。嗜熱擬青霉(Paecilomycesthermophile)葡聚糖酶在畢赤酵母中的表達(dá)產(chǎn)物的最適溫度為70 ℃，最適pH 7.0[13]。李一男等[14]進(jìn)一步篩選到這種酶的一個耐酸性突變體，其最適pH降至5.5。耐酸性是黑曲霉重要特點之一，是糖化酶、537酸性蛋白酶等多種耐酸性酶制劑的生產(chǎn)菌。2007年，黑曲霉CBS 513.88基因組序列被公布[15]，這些信息為研究人員發(fā)掘新型葡聚糖酶提供了有利條件[4]。該文前期對黑曲霉基因組中可能編碼葡聚糖酶的多條基因逐個進(jìn)行cDNA克隆和異源表達(dá)，并初步檢測其酶學(xué)性質(zhì)，以篩選性能優(yōu)良的葡聚糖酶及其編碼基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑曲霉基因組中一條被標(biāo)注為內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶A的基因(GenBank登錄號：XM_001389540)，其cDNA表達(dá)產(chǎn)物的耐熱性和耐酸性明顯高于其他基因的產(chǎn)物，而這條基因的高效表達(dá)和重組酶酶學(xué)性質(zhì)尚缺乏研究報道，該文主要對該基因在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)及重組酶性質(zhì)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

黑曲霉(A.niger) CICIM F0510由江南大學(xué)教育部工業(yè)微生物資源信息平臺提供；巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris) GS115和表達(dá)載體pPIC9K購自Invitrogen公司，本文構(gòu)建的重組菌巴斯德畢赤酵母pPIC9K-eglA6b HB133已保藏在中國高校工業(yè)微生物資源信息平臺，保藏編號為CICIM Y1489。

1.2 主要試劑

UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒、一步法RT-PCR試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；重組DNA所使用的限制性核酸內(nèi)切酶等購自大連寶生物工程公司；表達(dá)載體構(gòu)建時采用Prime star進(jìn)行PCR擴增以保證PCR產(chǎn)物5′端為平末端;羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、大麥葡聚糖β-Glucan (barley)、燕麥葡聚糖β-Glucan(oat)、地衣多糖(lichenan)、酵母葡聚糖β-Glucan(yeast)、茯苓多糖(pachyman)和凝結(jié)多糖(curdlan)均購自Megazyme公司；G418購自Invitrogen公司，酵母氮基YNB購自Difco公司，該產(chǎn)品中不含組氨酸。其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。引物、全基因合成和DNA測序均委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.3 黑曲霉葡聚糖酶基因的克隆與載體構(gòu)建

1.3.1 黑曲霉內(nèi)切葡聚糖酶cDNA基因的克隆

根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI) GenBank數(shù)據(jù)庫公布的黑曲霉CBS 513.88基因組序列中一條標(biāo)注為內(nèi)切葡聚糖酶A的cDNA序列(登錄號：XM_001389540)，設(shè)計引物擴增目的基因，引物如下：

Peg01 5′-ATGAAGACTCTCTCCCTTG-3′；

Peg02 5′-GAGATATAGCTAACC-3′。

以UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取黑曲霉CICIM F0510的總RNA，以一步法RT-PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增。電泳分離并回收PCR擴增產(chǎn)物中1.2 kb左右的片段，與pMD18T-simple連接，連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，任取4個轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒后送上海生工生物工程公司測序，測序結(jié)果顯示其中3個質(zhì)粒為插入了葡聚糖酶編碼基因的重組質(zhì)粒，3個轉(zhuǎn)化子中插入片段的序列完全一致。插入片段的序列已登錄GenBank，登錄號為：MG913988。任取其中1個質(zhì)粒命名為pMD-eglA6用于表達(dá)載體的構(gòu)建。

1.3.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)所擴增葡聚糖酶基因的序列，設(shè)計引物如下：

Peg03 5′-AGTCCGAGGGCTA AGC-3′；

其中,引物Peg03與eglA6基因成熟肽編碼區(qū)5′端一致，Peg04下劃線部分與eglA6基因編碼區(qū)3′端序列互補。以pMD-eglA6為模版，用引物Peg03和Peg04擴增目的基因，擴增產(chǎn)物純化后用NotⅠ單酶切，與經(jīng)SnaB Ⅰ和NotⅠ雙酶切的表達(dá)載體pPIC9K連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞。任取轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，用引物Peg03和Peg04進(jìn)行PCR驗證，其中能獲得大小約為1.1 kb的擴增產(chǎn)物的質(zhì)粒為插入了目的片段的重組質(zhì)粒。由于重組質(zhì)粒構(gòu)建時目的片段的5′端是未經(jīng)酶切，直接與載體上由SnaBI酶切產(chǎn)生的平末端連接，這種連接有可能出現(xiàn)目的片段5′端部分堿基的丟失，因此任選了10個重組質(zhì)粒進(jìn)行測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有3個重組質(zhì)粒所含片段與預(yù)計的擴增序列完全一致，即載體中的插入片段序列均與eglA6基因成熟肽編碼區(qū)完全一致。任取其中1個質(zhì)粒命名為pPIC9K-eglA6，用于重組畢赤酵母的構(gòu)建。

按照巴斯德畢赤酵母甲醇氧化酶基因密碼子使用規(guī)律對eglA6基因成熟肽編碼區(qū)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的基因命名為eglA6b并登錄GenBank，登錄號為：MG913989。基因eglA6b由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成并與載體pUK連接，重組載體命名為pUK-eglA6b。

根據(jù)eglA6b的序列設(shè)計引物如下:

Peg05 5′-TCTCCAAGAGCCAAGAG-3′；

Peg06 5′-ATGCGGCCGCTTACAGACACTGAGAG-3′。

以質(zhì)粒pUK-eglA6b為模板，采用PCR擴增eglA6b基因成熟肽編碼區(qū)，采用與上述pPIC9K-eglA6相同的方式構(gòu)建重組質(zhì)粒，并測序驗證獲得插入片段序列與eglA6b成熟肽編碼區(qū)完全一致的重組質(zhì)粒，所獲得的重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-eglA6b。

1.4 黑曲霉葡聚糖酶基因的表達(dá)、重組酶純化與酶活測定

1.4.1 重組巴斯德畢赤酵母的構(gòu)建

用BglⅡ分別酶切重組質(zhì)粒pPIC9K-eglA6和pPIC9K-eglA6b獲得線性化的重組質(zhì)粒，經(jīng)過PCR純化試劑盒純化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化物涂布不含組氨酸的MD平板，30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，轉(zhuǎn)化子形成菌落后任選20個菌落劃線分離，對應(yīng)每個轉(zhuǎn)化子在分離平板上任取3個單菌落的上清液進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，取平均值分析轉(zhuǎn)化子酶活。

1.4.2 重組畢赤酵母的誘導(dǎo)表達(dá)

重組畢赤酵母的誘導(dǎo)表達(dá)的方法以及所使用的培養(yǎng)基MD、BMGY、BMMY等均與文獻(xiàn)[16]一致。

1.4.3 葡聚糖酶的純化與酶活測定

粗酶液用0.22 μm微孔濾膜過濾除去雜質(zhì)，pH 5.5,5 mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡后上樣于1 mL QHP陰離子交換柱，用含1 mol/L NaCl的pH 5.5，5 mmol/L Tris-HCl緩沖液線性洗脫，進(jìn)行離子交換層析，收集活性峰。純化產(chǎn)物用SDS-PAGE電泳驗證純化效果，Bradford法測定蛋白含量,純酶用于酶學(xué)性質(zhì)分析。

參考YAN等[17]的方法采用DNS法測定內(nèi)切葡聚糖酶的活力。取0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液，加入4.5 mL，1%底物(0.05 mol/L檸檬酸-0.1 mol/L Na2HPO4緩沖液配制，pH 4.0)，75 ℃下反應(yīng)20 min，加入7.5 mL DNS試劑，煮沸15 min，在540 nm波長下測定吸光值。如無特別說明，檢測底物均為大麥葡聚糖。

酶活單位定義：在相應(yīng)條件下，每分鐘分解大麥葡聚糖或其他底物產(chǎn)生的還原糖，其還原力相當(dāng)于1 μmol葡萄糖所需的酶量，用1 U表示。

1.5 酶學(xué)性質(zhì)的分析

1.5.1 最適pH值和pH穩(wěn)定性的測定

分別配制pH為3.0～7.0的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液，在75 ℃下，測定酶在不同pH值緩沖液中酶活力，以最高酶活性為100%，計算不同pH值條件下相對活性。在50 ℃將酶液分別在pH 2～7緩沖液中保溫，每隔1 h取樣，在最適條件下測定酶活，以未經(jīng)處理的原酶液活性為100%，分析重組酶的pH值穩(wěn)定性。

1.5.2 最適溫度及溫度穩(wěn)定性的測定

在pH值4.0條件下，55～85 ℃范圍內(nèi)，間隔5 ℃測定不同溫度對酶活力的影響，以最高酶活性為100%，計算各溫度條件下酶相對活性。將酶液分別在70、75、80 ℃中保溫，每隔1 h取樣，在最適條件下測定酶活，以未經(jīng)熱處理的原酶液活性為100%，分析重組酶的溫度穩(wěn)定性。

1.5.3 金屬離子對酶活的影響

研究金屬離子對酶活的影響，在pH 4.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中分別添加金屬離子(均為氯化物)至終濃度為1 mmol/L和5 mmol/L檢測酶活。以原酶液活力為100%，分析不同金屬離子對酶活力的影響。

1.5.4 重組酶對不同底物特異性研究

分別以大麥葡聚糖、酵母葡聚糖、CMC-Na等為底物，在最適條件下測定重組酶的活力，分析重組酶對不同底物的水解能力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉葡聚糖酶基因eglA6的克隆、表達(dá)與功能鑒定

在本研究前期工作中，以黑曲霉CBS 513.88基因組序列中標(biāo)注為葡聚糖酶的cDNA序列為依據(jù)設(shè)計引物，以黑曲霉總RNA為模版，經(jīng)RT-PCR獲得可能編碼葡聚糖酶的cDNA基因編碼區(qū)并測序。用信號肽在線分析軟件SignalP對這些基因片段進(jìn)行分析，確定其成熟肽編碼區(qū)，再進(jìn)一步根據(jù)成熟肽編碼區(qū)序列設(shè)計引物PCR獲得成熟肽編碼區(qū)，與載體pPIC9K連接獲得重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母，一般取10～20個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初步搖瓶發(fā)酵，檢測發(fā)酵液酶活及耐熱性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以Peg01和Peg02為引物，經(jīng)RT-PCR獲得的cDNA基因的成熟肽編碼區(qū)的表達(dá)產(chǎn)物具有明顯高于其他基因表達(dá)產(chǎn)物的耐熱性。這條基因的RT-PCR擴增片段如圖1所示，片段大約為1 200 bp，與預(yù)測的葡聚糖酶基因理論值1 250 bp基本一致。該片段分離純化后與pMD18T simple連接，陽性轉(zhuǎn)化子測序結(jié)果顯示，擴增片段與黑曲霉CBS 513.88基因組序列中一段標(biāo)注為內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶基因的cDNA片段的核苷酸序列(GenBank登錄號：XM001389540.2)基本一致，兩者在編碼區(qū)內(nèi)有11個堿基不同，所編碼的多肽鏈的氨基酸序列則完全一致。由于黑曲霉基因組中有多條基因被標(biāo)注為葡聚糖酶編碼基因，而上述PCR產(chǎn)物是本研究前期工作中所鑒定的黑曲霉基因組中的第6條葡聚糖酶基因，為便于敘述本文將該基因命名為eglA6，其序列已登錄GenBank，登錄號為：MG913988。用SignalP分析顯示，該基因編碼的蛋白N端存在1個19個氨基酸殘基的信號肽，其余381個氨基酸殘基構(gòu)成酶的成熟肽。該成熟肽理論分子量41.3 Ku，等電點pI=3.81。進(jìn)一步擴增該基因的成熟肽編碼區(qū)，擴增產(chǎn)物與表達(dá)載體pPIC9K連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-eglA6，線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，任選20個轉(zhuǎn)化子，劃線分離后進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。發(fā)酵液在70 ℃條件下檢測酶活，結(jié)果顯示，其中17個轉(zhuǎn)化子的酶活在560～910 U/mL，另外3個轉(zhuǎn)化子則與用空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化得到的對照菌一樣,幾乎沒有酶活。可見基因eglA6編碼的是一種有較高耐熱性的葡聚糖酶，為便于敘述該重組酶命名為AneglA6。

M-5 kb maker；1-內(nèi)切葡聚糖酶基因eglA6的PCR產(chǎn)物圖1 eglA6基因的RT-PCR產(chǎn)物Fig.1 RT-PCR products of the eglA6

2.2 重組葡聚糖酶基因的密碼子優(yōu)化與重組酶的純化

為了提高eglA6的表達(dá)水平，根據(jù)巴斯德畢赤酵母甲醇氧化酶基因的密碼子組成，對eglA6的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的基因命名為eglA6b，其序列已登錄GenBank，登錄號為MG913989。將人工合成的eglA6b與表達(dá)載體pPIC9K連接，構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-eglA6b并在線性化后轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母，隨機挑選其中20個轉(zhuǎn)化子菌落，劃線分離后進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，并檢測發(fā)酵液中的葡聚糖酶酶活，結(jié)果顯示其中14個轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)出較高的酶活，6個轉(zhuǎn)化子沒有明顯酶活。上述14個轉(zhuǎn)化子的酶活檢測結(jié)果和2.1中17個轉(zhuǎn)化子檢測結(jié)果如圖2和圖3所示。含有未經(jīng)密碼子優(yōu)化的eglA6基因的17個轉(zhuǎn)化子平均酶活為644.2 U/mL。含有密碼子優(yōu)化后的基因eglA6b的轉(zhuǎn)化子的平均酶活為1805.9 U/mL。可見，密碼子優(yōu)化明顯提高了葡聚糖酶的表達(dá)水平，AneglA6表達(dá)水平提高幅度達(dá)1.8倍以上。

圖2 pPIC9K-eglA6轉(zhuǎn)化子酶活Fig.2 Enzyme activity of pPIC9K-eglA6 transformants

圖3 pPIC9K-eglA6b 轉(zhuǎn)化子酶活Fig.3 Enzyme activity of pPIC9K-eglA6b transformants

為了篩選表達(dá)水平較高的轉(zhuǎn)化子，大量制備線性化的pPIC9K-eglA6b，轉(zhuǎn)化宿主菌GS115，將轉(zhuǎn)化子點種到含3 mg/mL G418的YPD平板上篩選可能含高拷貝外源基因表達(dá)單元的轉(zhuǎn)化子。

經(jīng)多次轉(zhuǎn)化，共獲得在3 mg/mL G418的YPD平板上生長的轉(zhuǎn)化子120個，分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，其中編號為HB133的轉(zhuǎn)化子獲得最高發(fā)酵酶活，為3 031.8 U/mL。該轉(zhuǎn)化子命名為PichiapastorisGS115/pPIC9K-eglA6b HB133，簡稱HB133，用于重組酶酶學(xué)性質(zhì)研究。

將重組菌HB133的表達(dá)產(chǎn)物用離子交換的方法進(jìn)行純化。SDS-PAGE電泳顯示，純化后的內(nèi)切葡聚糖酶表現(xiàn)為單一電泳條帶(圖4)。

M-蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量；1-HB133發(fā)酵上清液；2-從HB133發(fā)酵上清液純化的AneglA6; 3-- GS115/pPIC9K的發(fā)酵上清液圖4 重組葡聚糖酶SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE analysis of AneglA6

用圖像分析軟件Image lab 4.0分析顯示，重組蛋白分子量約為52 ku，比AneglA6成熟肽理論分子量41.3 ku高出約20%，這是用酵母表達(dá)系統(tǒng)外源蛋白時的常見現(xiàn)象，一般是重組蛋白在分泌過程中被糖基化所致。

2.3 AneglA6酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 重組酶最適反應(yīng)溫度

將純化獲得的酶液適當(dāng)稀釋，分別在不同溫度下測定酶活，以最高酶活作為100%，結(jié)果如圖5所示。在55～75 ℃，重組酶的酶活隨溫度的升高而升高，溫度高于75 ℃后酶活顯著下降，在80 ℃時，酶活下降至最高酶活的77.4%。從圖5可見，AneglA6在75 ℃以下條件下保持基本穩(wěn)定，高于此溫度酶在檢測過程中的變性失活已明顯影響酶促反應(yīng)結(jié)果。重組酶的最適作用溫度是75 ℃。AneglA6是1種耐熱型葡聚糖酶。

圖5 溫度對AneglA6活力的影響Fig.5 Effects of temperature on the activity of AneglA6

2.3.2 重組酶最適反應(yīng)pH值

將酶液適當(dāng)稀釋，分別在不同pH值下測定酶活，以最高酶活作為100%，結(jié)果如圖6所示。重組酶AneglA6在pH 3.0～5.5，酶活均在最高酶活的50%以上。重組酶的最適pH值為4.0，在pH 4.0～5.0，酶活力保持在最高酶活的80%以上，重組酶AneglA6是1種酸性葡聚糖酶。雖然AneglA6是1種酸性葡聚糖酶，但在pH 7的條件下其仍然能夠保持約34%的酶活。

圖6 pH值對AneglA6活力的影響Fig.6 Effects of pH on the activity of AneglA6

2.3.3 重組酶在不同條件下的酶活

為了進(jìn)一步分析AneglA6在比較寬的條件下的酶活，在pH為3～7和35～75 ℃檢測酶活，結(jié)果如圖7所示。由圖7可見，當(dāng)pH值和溫度偏離最適條件時，AneglA6的酶活均逐步下降，但在pH 7和35 ℃條件下AneglA6仍能保留約20%的酶活。由于在飼料工業(yè)中，葡聚糖酶主要是在動物腸道的中性環(huán)境發(fā)揮作用，這一性質(zhì)對于AneglA6在飼料工業(yè)中的應(yīng)用有一定的意義。

2.3.4 重組酶溫度和pH值穩(wěn)定性

將酶液在不同溫度下保溫后檢測酶活，結(jié)果顯示，在65 ℃以下，AneglA6活性穩(wěn)定，酶活半衰期均在12 h以上。50 ℃是糖化反應(yīng)的常用溫度，在50 ℃連續(xù)保溫12 h，AneglA6的酶活損失不足10%。在70 ℃以上，隨著保溫時間的延長，AneglA6的酶活有明顯下降。70、75、80 ℃條件下保溫一定時間后剩余酶活力變化情況如圖8所示。由圖8可見，在70 ℃和75 ℃下保溫，AneglA6酶活隨時間延長有明顯下降，但依然在相當(dāng)長的時間內(nèi)保持較高酶活，實際檢測發(fā)現(xiàn)其酶活半衰期分別為4.6、1.9 h。在80 ℃下，酶活下降很快，實際測定其酶活半衰期約為23 m，可見AneglA6能短時耐受80 ℃高溫。

圖8 AneglA6的熱穩(wěn)定性Fig.8 Thermostability of the AneglA6

AneglA6對不同pH環(huán)境的適應(yīng)性很強，在50 ℃、pH 2～8，AneglA6的酶活半衰期均在12 h以上，由此可見,不同pH環(huán)境影響酶的催化效率但并不導(dǎo)致酶的變性。

2.3.5 金屬離子對重組酶活力的影響

不同金屬離子對重組酶AneglA6的影響如表1所示。從表1可以看出，大部分常見金屬離子以及EDTA均對AneglA6酶活影響不大。Co2+、Mn2+對酶的活性有一定的促進(jìn)作用，5.0 mmol/L的Fe3+對酶活有較明顯的抑制作用。

表1 同金屬離子對AneglA6催化活力的影響Table 1 Effects of metal ions on AneglA6 activity

2.3.6 重組酶底物特異性

重組酶對不同底物的水解能力檢測結(jié)果如表2所示。以地衣多糖為底物時重組酶活性最高，比酶活為17 445.2 U/mg，以大麥葡聚糖和燕麥葡聚糖為底物時，比酶活分別為12 450.6 U/mg和12 004.1 U/mg。以CMC-Na為底物時酶活較低，為1 645.7 U/mg。以酵母葡聚糖、凝結(jié)多糖和茯苓聚糖為底物時，重組葡聚糖酶沒有表現(xiàn)出明顯的酶活。酵母葡聚糖等3種葡聚糖都是葡萄糖分子以β-1,3-糖苷鍵連接而獲得的β-1,3-葡聚糖，AneglA6對這3種分子都不具有降解能力，可見AneglA6不降解β-1,3-糖苷鍵。另外本研究所采用的2種葡聚糖和地衣多糖分子中均含有一定量的β-1,3-糖苷鍵，這種糖苷鍵可以阻擋外切型葡聚糖酶對底物的連續(xù)降解，從AneglA6對這3種分子的降解情況看，β-1,3-糖苷鍵并不能阻擋其對這3種糖的降解。AneglA6雖然不水解β-1,3-糖苷鍵，但其對含β-1,3-糖苷鍵的大麥和燕麥葡聚糖的水解效率遠(yuǎn)高于對CMC-Na的水解效率，而對β-1,3-糖苷鍵含量相對較高的地衣多糖的水解效率則又高于上述2種葡聚糖。內(nèi)切型β-葡聚糖酶的一個重要特點是主要降解與β-1,3-糖苷鍵臨近的β-1,4-糖苷鍵[5]，AneglA6符合這一特點。從上述分析看，AneglA6是1種內(nèi)切型β-1,4- 葡聚糖酶。

表2 AneglA6的底物特異性Table 2 Substrates specificity of AneglA6

3 結(jié)論與討論

2001年，HONG等[18]首次從黑曲霉中克隆了1條葡聚糖酶基因eng1，初步分析顯示其編碼產(chǎn)物是1種具有較高耐熱性的內(nèi)切型β-葡聚糖酶。2003年，HARA等[19]以纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域特征序列為探針，從黑曲霉的近緣種Aspergilluskawachii中克隆了1條纖維素酶基因Cel5A，進(jìn)一步又以Cel5A為探針克隆了另外2條同源序列Cel5B和Cel61A，并初步驗證了前2條基因編碼產(chǎn)物的葡聚糖酶活性。對氨基酸序列的比對可以發(fā)現(xiàn)Cel5B和eng1是同一種分子。由于Cel5B具有很高的熱穩(wěn)定性和一定的耐酸性，因此成為真菌葡聚糖酶研究的熱點之一，國內(nèi)外很多研究者進(jìn)行了該基因高效表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)的研究[5,7-8,17,20-21]。為了開發(fā)更多的葡聚糖酶資源，董自星等以黑曲霉基因組信息為依據(jù)克隆了黑曲霉的另外3條葡聚糖酶的cDNA并對重組酶性質(zhì)進(jìn)行了比較詳細(xì)的研究[4]。不同文獻(xiàn)對黑曲霉來源的不同葡聚糖酶進(jìn)行報道時重組酶的名稱不完全統(tǒng)一，本研究根據(jù)文獻(xiàn)提供的引物序列等信息將葡聚糖酶與黑曲霉CBS 513.88的基因組信息比對后進(jìn)行總結(jié)見表3。由表3可見，目前酶學(xué)性質(zhì)研究比較清楚的黑曲霉來源的β-葡聚糖酶基因表達(dá)產(chǎn)物均具有一定的耐熱性和耐酸性，其中CelB和本文表達(dá)的AneglA6的耐熱性和耐酸性均比較突出。該研究前期工作曾經(jīng)對黑曲霉中可能編碼葡聚糖酶的基因逐個進(jìn)行異源表達(dá)和重組酶性質(zhì)的初步分析，也發(fā)現(xiàn)CelB和AneglA6的耐熱性明顯高于其他基因。可能由于實驗方法或表達(dá)體系的差異，不同研究者報道的CelB的酶學(xué)性質(zhì)有一定的差異，但CelB的最適溫度均在60～70 ℃。本研究對CelB的研究結(jié)果與YAN等[17]的報道基本一致。在相同實驗條件下對兩者進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：兩者最適pH值接近，均為4.0左右，但CelB對低pH值條件的適應(yīng)性較弱，在pH 3.0條件下，CelB的酶活不到最高酶活的10%，而AneglA6的酶活接近最高酶活的50%。AneglA6除了最適溫度高于CelB外，其熱穩(wěn)定性明顯高于CelB。在70 ℃條件下，AneglA6的酶活半衰期在4 h以上，而CelB保溫1 h后失去大部分酶活。YAN等[17]和MURRAY等[21]的報道也顯示CelB在70 ℃保溫1 h后失去大部分酶活。AneglA6在75 ℃能保持一定時間的穩(wěn)定，半衰期在1.9 h。由于75 ℃是飼料造粒的常用溫度，這一特征對AneglA6在飼料加工中耐受造粒階段的高溫環(huán)境有一定的意義。

表3 黑曲霉來源的葡聚糖酶基因表達(dá)產(chǎn)物的比較Table 3 Comparison of expression products of different genes encoding β-glucanase from Aspergillus niger

黑曲霉本身并未發(fā)現(xiàn)耐熱性很高的葡聚糖酶，根據(jù)MURRAY等[21]的研究，黑曲霉本身表達(dá)的野生型CelB的最適溫度只有60 ℃，其熱穩(wěn)定性比畢赤酵母表達(dá)的重組酶降低了10 ℃，而重組酶的分子量則明顯大于野生酶，這可能源于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對外源蛋白的過度糖基化。MURRAY等[21]認(rèn)為酵母表達(dá)系統(tǒng)對重組酶的修飾可能與酶的耐熱性提高有一定的關(guān)系。本研究采用巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對AneglA6進(jìn)行異源表達(dá)，重組酶最適溫度達(dá)75 ℃。由于目前缺乏黑曲霉自身所表達(dá)的AneglA6的資料，無法斷定畢赤酵母表達(dá)的重組酶的耐熱性是否高于野生酶。考慮到在黑曲霉中從未發(fā)現(xiàn)最適溫度高于60 ℃的野生型葡聚糖酶，重組AneglA6的高熱穩(wěn)定性很可能在一定程度上來源于巴斯德畢赤酵母對酶分子的糖基化修飾。

與目前已報道的來源于真菌β-葡聚糖酶相比，AneglA6的主要特點是對高溫和酸性條件均具有較強的耐受性和適應(yīng)性。重組酶AneglA6最適溫度為75 ℃，在70 ℃下酶活半衰期為4.6 h。AneglA6的耐熱性已經(jīng)和一些嗜熱真菌來源的葡聚糖酶接近[5, 12-14, 21]。AneglA6最適pH值為4.0，在pH 3.0～5.5范圍內(nèi)酶活保持在最高酶活的50%以上。AneglA6對低pH值的適應(yīng)性明顯超過耐熱真菌來源的葡聚糖酶。綜上所述，在酸熱條件下的穩(wěn)定性和高活性是AneglA6的主要特點，AneglA6在飼料、啤酒工業(yè)，以及其他需要在高溫酸性條件進(jìn)行的生產(chǎn)加工工藝中有一定的應(yīng)用前景。