熱凝膠在堿溶過程的流變學和質構學行為分析

葉劍，鄭志永，詹曉北，蔣蕓

(江南大學 生物工程學院，糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

熱凝膠(curdlan)又稱凝膠多糖、可德蘭膠、可得然膠等，是一種由微生物產生的胞外多糖，分子內以β-1,3-糖苷鍵連接而成，具有加熱成膠的獨特特性[1-2]，本研究采用最為貼切的熱凝膠為名。熱凝膠分子通常以右手三螺旋結構存在，具有熱成膠性、抗脫水性及抗凍融性等特點[3]。1996年，熱凝膠多糖獲美國FDA批準成為一種食品添加劑[4]，現在，熱凝膠多糖已廣泛應用于食品工業，主要作為凝膠劑、結構改性劑、持水劑、黏合劑、增稠劑等用于果凍、肉產品、低熱量食品等的制作[5-6]。WEST和SALAH等[7-10]研究了以不同原料為底物發酵生產熱凝膠。本實驗室對熱凝膠發酵和提取工藝做了深入的研究[11-12]，分析了熱凝膠合成的機理，對生產熱凝膠的菌株進行了育種和篩選[13-16]。

在熱凝膠提取過程中，發酵液中菌體和熱凝膠都是水不溶性物質[17]，相互黏附，密度差小，粒徑微小，屬固-固分離，分離難度大。熱凝膠可溶解在二甲亞砜[18]和NaOH溶液[19]等堿性溶劑中，提取過程中一般先將熱凝膠溶于堿溶液中形成溶膠，使固-固分離轉變成固-液分離，降低分離難度。堿溶后的熱凝膠形成高黏度的溶膠，通過壓濾等手段將膠液中的菌體分離去除，因此溶膠體系黏度的大小等流變性質是影響分離難易度的重要因素。與此同時，堿對熱凝膠產品品質有損傷作用[17]，同時強堿對菌體有裂解作用，釋放出雜質，因此堿溶處理方式影響產品的純度和質量；若溶解不徹底，除菌時易堵塞過濾設備，影響分離效率。因此需要對堿溶過程中熱凝膠的流變學、堿溶過程對熱凝膠產品質構學的影響等開展研究。本研究主要集中于分析熱凝膠溶解于堿液過程中的顆粒形態、流變學及質構學性質，探尋在不同處理方式下適用于工業提取熱凝膠的方法，為熱凝膠工業化提取提供基礎數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熱凝膠發酵產物，實驗室通風發酵所得[20]；食品級熱凝膠，購自日本麒麟公司；NaOH、HCl：分析純，上海國藥集團。

1.2 儀器與設備

Haake Mars Ⅲ流變儀，美國賽默飛世爾科技；MD-NJ-5凝膠強度測定儀，臨安豐源電子有限公司；TA.XT Plus質構儀，英國SMS公司；離心機，德國Sigma公司；組合式搖床，上海國強生化有限公司；HHS恒溫水浴鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 熱凝膠的處理方法

熱凝膠一部分來源于實驗室通風發酵所得，為發酵原液，含有土壤桿菌菌體，用于觀察熱凝膠溶解狀態；另一部分熱凝膠購自日本麒麟公司，是提取過后的食品級產品。取5 g食品級熱凝膠置于500 mL錐形瓶，加入50 mL去離子水充分混勻，稱取配制成實驗要求堿濃度(0.2～1.0 mol/L)所需的NaOH，溶于200 mL去離子水中，待冷卻后加入錐形瓶中。按照下文所述單因素實驗設計條件將錐形瓶置于回旋式搖床振蕩溶解，溶解后取溶膠在流變儀中進行流變學分析，剩余溶膠滴加0.5 mol/L HCl溶液攪拌中和，使pH達到7.0，熱凝膠析出，8 000 r/min、10 min離心洗滌3次，收集離心物得到熱凝膠濕膠，用于后續質構分析。

1.3.2 單因素試驗設計

1.3.2.1 溶解時間

以實驗室發酵產物為原料，取50 mL含有土壤桿菌的發酵液，8 000 r/min離心10 min得到沉淀物，將沉淀物振蕩(200 r/min，30 ℃)溶解于50 mL濃度為0.25 mol/L的堿溶液中，每隔30 min取樣，滴加數滴質量分數為1%的苯胺藍和質量分數為1%中性紅混合染色液，混勻染色3 min，通過光學顯微鏡觀察熱凝膠是否充分溶解。

1.3.2.2 堿處理時間

以市售熱凝膠為原料，按1.1方法將熱凝膠與NaOH溶液混合，配制成熱凝膠質量分數為2%、NaOH終濃度為0.5 mol/L的體系，于30 ℃、200 r/min條件下分別回旋振蕩0.5、1、2、4、6 h，取溶膠進行穩態流變學分析，提取所得熱凝膠進行質構分析。

1.3.2.3 堿溶溫度

以市售熱凝膠為原料，按1.1方法將熱凝膠與NaOH溶液混合，配制成熱凝膠質量分數為2%、NaOH終濃度為0.5 mol/L的體系，置于恒溫水浴鍋中200 r/min回旋振蕩2 h，水浴溫度分別設置為15、20、25、30、35、40 ℃。對樣品進行穩態流變學和質構分析。

1.3.2.4 堿濃度

以市售熱凝膠為原料，將熱凝膠與NaOH溶液混合，配制成熱凝膠質量分數為2%，NaOH終濃度分別為0、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.5、0.7、1 mol/L的體系，于30 ℃、200 r/min條件下回旋振蕩2 h，取溶膠進行進行流變學分析，提取所得熱凝膠進行質構分析。

1.3.3 熱凝膠質構分析

1.3.3.1 凝膠強度測定與分析

取5 g熱凝膠濕膠放在烘干并精確稱重后的錫箔紙上，105 ℃烘至恒重后稱量，計算濕膠與干膠重量比，分析其含水率。取15 g熱凝膠濕膠，根據其含水率補充或高速離心去除部分水使其熱凝膠質量分數為2%，按照國家標準GB 28304—2012[21]所述方法測定熱凝膠的凝膠強度。采用MD-NJ-5凝膠強度測定儀分析凝膠強度，探頭為圓柱形探頭，平端面積1 cm2。樣品截面積大于探頭面積，穿刺模式，測試前速度1 mm/s，測試時速度為1 mm/s，測試后速度為1 mm/s，得到破裂曲線，根據負荷-時間曲線計算凝膠強度，凝膠強度按公式(1)計算：

W=F/A

(1)

式中：W，凝膠強度，g/cm2；F，凝膠破裂時曲線急劇下降拐點的力，g；A,探頭末端平面面積，cm2。

1.3.3.2 凝膠樣品全質構分析(texture profile analysis, TPA)

采用TA.XT plus質構分析儀的壓縮模式測定熱凝膠的機械性能。探頭型號為P/0.5R，測試前速度1 mm/s，測試時速度為1 mm/s，測試后速度為1 mm/s，目標模式為應變，壓縮形變量為50%，測試時間5 s，觸發力為10 g，得到全質構曲線。實驗質構分析參數[22-23]有：(1)硬度，第一次壓縮循環的最大值。(2)黏性：模擬用以克服探頭與樣品表面間吸引力所必需的工作，是第一次循環測試曲線在橫坐標下方的面積。(3)內聚性：模擬樣品內部粘合力，樣品經壓縮變形后對再次壓縮的相對抵抗力，內聚性=第二次壓縮面積/第一次壓縮面積。(4)彈性：變形樣品去除變形力后恢復至原高度或體積的比率。(5)咀嚼性：模擬將固體樣品咀嚼成可吞咽狀態所需的能量，咀嚼性=硬度×內聚性×彈性。(6)回復性：變形樣品在導致變形相同的速度、壓力作用下的回復程度，回復性=回復面積/壓縮面積。

1.3.4 溶膠流變學分析

1.3.4.1 穩態流變學分析

經過堿溶處理后得到的熱凝膠溶膠，采用Haake Mars III流變儀進行穩態流變學實驗。實驗溫度25 ℃，轉子型號C60/1° Ti L，間隙d=0.052 mm，剪切速率0.1～100 1/s。通過剪切應力(τ)與剪切速率(γ)之間關系的曲線來判斷流體流變模型。流體的簡單流動行為可表示為[24]：

τ=τy+Kγn

(2)

式中：τ為剪切應力，Pa；τy為屈服應力張量，牛頓流體、冪律流體τy值為0，賓漢塑性流體τy大于0，只有在應力超過屈服點時，流體出現流動，在屈服前，流體實際是彈性固體；K為流體的稠度系數，數值與液體的稠度和濃度有關，K越大，流體越黏，即流動阻力越大，mPa·sn；γ為剪切速率，1/s；n為流動指數，n的大小表示流體偏離牛頓流體的程度，當n=1，流體為牛頓流體，當n>1，流體為脹塑性流體，當0

1.3.4.2 動態流變學

在動態模式測定前，需確定樣品的線性黏彈性范圍，實驗溫度25 ℃，轉子型號P60 Ti L，間隙d=1 mm，頻率f=1 Hz，應變λ=0.01%～100%進行檢測。確定線性黏彈區后進行動態流變學分析，采用頻率掃描模式，轉子型號P60 Ti L，間隙d=1 mm，應變λ根據線性黏彈區范圍來選擇，頻率f=0.1～100 Hz。

2 結果與分析

2.1 堿處理時間對熱凝膠的影響

熱凝膠和菌體混合懸濁液在堿溶前，如圖1-a所示，熱凝膠形成晶狀顆粒，顆粒聚集成團塊，染色后呈暗紅色，熱凝膠顆粒長徑約15～25 μm，短徑約10～12 μm，菌體被包裹和固定在半透明的熱凝膠顆粒內或表面；0.25 mol/L NaOH溶液中堿溶30 min后懸濁液中顆粒物明顯變小，呈橙黃色，顯微鏡下可見更多游離的土壤桿菌菌體，熱凝膠顆粒長徑減至約2～4 μm，短徑減至約1～2 μm；堿溶60 min后，顯微鏡下只能觀察到桿狀的土壤桿菌菌體，染色程度較淺，菌體呈游離狀，可以判斷為熱凝膠顆粒完全溶解，因此堿溶時間初選為60 min，在后續的實驗中利用顯微鏡跟蹤觀察熱凝膠的溶解狀況。

圖1 堿處理不同時間后熱凝膠顆粒變化(放大倍數100×16)Fig.1 Curdlan particles changed after different time of alkali treatment (scale up 100×16)

堿溶后熱凝膠溶膠的穩態流變學分析結果如圖2所示，堿處理0.5 h時熱凝膠尚未完全溶解，樣品中存在固體顆粒，相比較于處理1 h后樣品，流體黏度值(η)倍增，稠度系數K高37%，流體流動性弱，流動指數n約為0.92，表現出非牛頓流體的特性。堿處理1 h后，熱凝膠完全溶解，處理1～6 h的溶膠流體黏度曲線線型較為一致，與處理0.5 h黏度曲線有較明顯區別，這表明熱凝膠溶解前后其流變學性質會發生變化，處理1 h以上黏度曲線線型一致也從側面說明1 h后熱凝膠完全溶解。熱凝膠完全溶解后，熱凝膠分子間氫鍵不斷被破壞[19]，其流體稠度系數隨時間增加而線性下降，表現為流體黏度的下降，流動指數n在0.94～0.97之間，流體接近于牛頓型流體。

溶膠按方法1.1處理得到熱凝膠濕膠，按1.3所述方法分析其凝膠強度，結果如圖2-b中所示，在6 h以內，堿處理時間對熱凝膠凝膠強度無影響。

圖2 不同堿處理時間熱凝膠黏度、n、K和凝膠強度變化Fig.2 Changes of viscosity, n, K and gel strength of curdlan at different alkali treatment time

在熱凝膠的工業提取過程中，不僅要關注產品質量，同時還要考慮到工作效率及經濟成本，在凝膠強度損失不大的情況下，溶膠黏度是選擇堿處理時間的重要指標，黏度越低，除菌時越容易，對設備要求越低，但處理時間過長影響提取效率，因此堿溶時間建議選擇2～4 h。

2.2 堿溶溫度對熱凝膠的影響

在不同溫度下對熱凝膠進行處理，其流變學結果如圖3所示，溶膠黏稠度隨處理溫度的升高而降低，溶膠流動指數n隨溫度基本不變，流體接近于牛頓流體。NaOH具有強烈的氫鍵破壞能力，熱凝膠溶解在堿溶液中以后，熱凝膠分子中由氫鍵連接而形成的有序結構被破壞，導致了其宏觀理化性質的變化，溫度的升高加劇了堿液對熱凝膠分子間氫鍵的破壞。

圖3 不同堿溶溫度處理對熱凝膠的影響Fig.3 Effect of different alkali solution temperature on curdlan

對熱凝膠樣品進行質構分析，結果如圖3、圖4所示。隨著處理溫度的提高，熱凝膠的凝膠強度、硬度和咀嚼性有所下降，較低溫度下堿液對熱凝膠結構的破壞作用[11]較小，提高溫度處理后其對熱凝膠結構的破壞性加劇；彈性、內聚性和回復性變化不大，說明樣品凝膠化后，在壓縮未破裂時組織結構穩定；實驗所測樣品黏性>內聚性，熱凝膠樣品組織間結合力小于凝膠表面吸引力，在探頭上升過程中有部分殘渣黏附在探頭上。

堿溶溫度升高，溶膠黏度下降，有利于過濾提取，但熱凝膠凝膠強度、硬度等質構性質下降，降低了熱凝膠的品質，在提取成本可接受范圍內應降低處理溫度以保證產品質量。工業提取過程中，設備一般在室溫工作或水冷降溫，工作時機械摩擦會導致溫度升高，為節約成本，堿溶在室溫進行，若溫度過高，則水冷降溫控制在20～30 ℃之間。

圖4 不同溫度處理熱凝膠固體樣品全質構分析結果Fig.4 Results of TPA of curdlan solid samples treated with different temperature

2.3 堿濃度對熱凝膠的影響

用不同濃度堿處理熱凝膠，實驗結果如圖5所示。從圖5-a、5-b可以看出，熱凝膠均質后未加入NaOH時，體系中存在顆粒性物質，流變學分析時剪切力大，黏度值高，均質液屬于賓漢塑性流體，屈服應力張量τy=8 Pa，需要對其施加高于τy的屈服力流體才表現出流動性。

★-0 mol/L NaOH; □-0.2 mol/L NaOH;○-0.25 mol/L NaOH;△-0.3 mol/L NaOH;▽-0.35 mol/L NaOH;◇-0.4 mol/L NaOH圖5 不同減濃度下熱凝膠溶膠流變學分析結果Fig.5 Rheology analysis results of curdlan sol at different alkali concentrations

均質液流體的彈性模量G′大于黏性模量G″，隨著掃描頻率f增大，G′變化平緩，G″緩慢增加，體系中以彈性成分為主，表現為凝膠的特征。隨著堿濃度的增高，熱凝膠完全溶解,樣品G″>G′，體系中以黏性成分為主，表現為液體的特征，熱凝溶膠黏度不斷下降，流體從賓漢塑性流體向牛頓流體轉變。當堿濃度小于0.3 mol/L時，堿溶液黏度值較高，堿濃度對溶液流變學性質影響程度較大，土壤桿菌分泌的熱凝膠天然構象呈三螺旋構象[25]，分子剛性大，三螺旋構象相互締合形成凝膠晶格，表現出膠凝性。熱凝膠分子在低濃度堿溶液(<0.3 mol/L)的作用下，螺旋之間的氫鍵被打斷，熱凝膠分子從三螺旋逐漸被解鏈成單鏈螺旋，分子鏈剛性下降，溶膠表現出黏性。當堿濃度高于0.3 mol/L時，熱凝膠分子內的氫鍵被進一步打斷，構象繼續發生變化，單鏈螺旋構象轉變成隨意盤曲的松散構象，分子締合度隨堿濃度增加而降低[19]，流體黏度值降低，不同堿濃度溶膠的流變學性質基本一致，此時堿濃度的增加對溶膠流變學性質的影響趨于不變。

將經過不同濃度堿處理得到的熱凝膠提取，配制成質量分數為2%的熱凝膠，凝膠化后進行質構分析。熱凝膠的解螺旋現象類似于蛋白質的變性過程，隨著堿濃度的增加，三螺旋構象被解體，形成無規則卷曲的線性分子。當加入酸中和后，三螺旋構象得到恢復，但不能完全恢復至天然狀態，因此導致凝膠強度的損失。如圖6和圖7所示，熱凝膠凝膠強度隨堿濃度的增加線性降低，強度下降幅度高于溫度對強度的影響，說明堿濃度對于凝膠強度的影響要大于溫度對其的影響，應盡量選擇較低的堿濃度處理。

圖6 不同堿濃度處理后熱凝膠凝膠強度Fig.6 Gel strength of curdlan treatment with different alkali concentrations

圖7 不同堿濃度處理熱凝膠固體樣品全質構分析結果Fig.7 Results of TPA of curdlan solid samples treated with different alkali concentrations

隨著堿濃度的增大，熱凝膠的硬度和咀嚼性都有所下降；而其彈性、內聚性和回復性變化不大，組織結構穩定。實驗所測樣品黏性>內聚性，組織間結合力小于凝膠表面吸引力，其各項指標變化與溫度對其影響變化一致，說明無論是溫度還是堿濃度，對于熱凝膠凝膠內部穩定性的影響都較小。

堿濃度對熱凝膠的品質和溶膠的黏度影響均較大，堿濃度高(>0.5 mol/L)時溶膠黏度低，有利于工業提取處理，但會大幅度降低熱凝膠的品質，同時消耗大量的堿，造成資源浪費。堿濃度低(<0.3 mol/L)時有利于保護熱凝膠，但溶膠黏度大，增加分離提取難度，降低處理效率。綜合考慮處理效率、成本、產品質量等因素，工業提取選擇0.3～0.5 mol/L的堿液終濃度較為合適。

3 結論

本研究考察了熱凝膠提取過程中的3個主要影響因素，通過分析樣品的流變學及質構學性質，選擇適合工業堿溶提取熱凝膠的條件。結果表明，(1)溶膠黏度隨堿處理時間延長而降低，溶膠接近于牛頓型流體，凝膠強度基本不變。(2)熱凝膠凝膠強度和溶膠黏度均隨堿溶溫度升高的而下降，較高的溫度處理會降低熱凝膠的品質，室溫或水冷環境下可以滿足工業要求。(3)隨著堿濃度的增加，流體從賓漢塑性流體向牛頓流體轉變。堿濃度低于0.3 mol/L時堿濃度增加溶膠流體性質變化大，堿濃度高于0.5 mol/L時堿濃度增加熱凝膠品質影響變化大。