酸肉發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的變化及對消化特性的影響

韋誠，段珍珍，常榮，周才瓊*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，暨重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400715) 2(習(xí)水縣市場監(jiān)督管理局，貴州 遵義，56400)

酸肉是流行于貴州、重慶、湖南、廣西及江西等一帶少數(shù)民族地區(qū)的一種特色發(fā)酵肉制品，具有酸香濃郁、易于消化等特點(diǎn)[1]。其多為家庭手工作坊生產(chǎn)，以持續(xù)發(fā)酵作為保藏方式，食用周期多達(dá)半年以上。由于長時(shí)間處于一定微生物和酸的條件下，使酸肉成為一個(gè)動(dòng)態(tài)體系，酸肉的風(fēng)味、營養(yǎng)及安全都會(huì)發(fā)生相關(guān)變化。

近年來，對肉制品品質(zhì)的研究不再局限于通過物理品質(zhì)、感官品質(zhì)或微生物安全的評價(jià)，許多研究者開始從蛋白質(zhì)和脂肪的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性的變化角度出發(fā)，更深層次地研究原料肉在加工過程中品質(zhì)的形成和劣變相關(guān)機(jī)理。蛋白質(zhì)作為肉類的重要組成成分，其在加工貯藏過程中發(fā)生的氧化、降解及結(jié)構(gòu)改變等理化變化對肉制品品質(zhì)起著關(guān)鍵性作用。其中，蛋白質(zhì)的降解最重要且對最終產(chǎn)品感官特性影響顯著[2]。一方面，蛋白質(zhì)在組織蛋白酶和微生物胞外蛋白酶作用下發(fā)生降解，生成小肽、游離氨基酸，甚至酮酸、胺和醛等風(fēng)味物質(zhì)或風(fēng)味前體物[3-4]，在一定程度上有利于風(fēng)味的發(fā)展和促進(jìn)產(chǎn)品的消化吸收[5]。另一方面，蛋白質(zhì)的持續(xù)降解可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品產(chǎn)生金屬味、苦澀味、酸澀味，加速產(chǎn)品腐敗。此外，加工過程中蛋白質(zhì)也容易發(fā)生氧化修飾，適當(dāng)?shù)难趸欣陲L(fēng)味的形成和蛋白消化率的提高，而嚴(yán)重的蛋白氧化引起的疏水性變化、羰基化及交聯(lián)聚集則可能會(huì)導(dǎo)致消化率下降[6]。對發(fā)酵食品而言，發(fā)酵既是一種加工方法也是一種食物保藏方法，不但延長了產(chǎn)品的貨架期，還促進(jìn)風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值的提升[7]。而肉類在發(fā)酵過程中牽涉了許多復(fù)雜的物理、生物化學(xué)和微生物的變化，主要包括：pH值降低、微生物區(qū)系的改變、亞硝酸鹽還原及亞硝基血紅蛋白生成、肌漿蛋白和肌原纖維蛋白溶解度的改變、蛋白組成的變化、酸化及蛋白凝膠化等[7-8]。這些變化與發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵劑、溫度及輔料(如鹽)添加量等密切相關(guān)。然而，目前關(guān)于酸肉發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的變化這方面的報(bào)道相對較少且不夠深入[9]。

該文從蛋白質(zhì)降解和聚集角度考察酸肉在長時(shí)間發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的基本變化規(guī)律，旨在為酸肉在長時(shí)間發(fā)酵過程中有關(guān)蛋白質(zhì)的變化及對酸肉蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值的影響提供依據(jù)，為合理控制發(fā)酵時(shí)間，以及何時(shí)食用提供有關(guān)蛋白質(zhì)變化的支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮豬里脊(背最長肌)、湖北大米及加碘食用鹽，重慶北碚天生路永輝超市。大米炒至微黃后，粉碎機(jī)粉碎后過20目篩，備用。

1.2 主要試劑

尿素、NaOH、十二烷基硫酸鈉(SDS)、NaCl、三氯乙酸、KCl、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、NaH2PO4、KH2PO4、β-巰基乙醇、茚三酮、考馬斯亮藍(lán)R-250等化學(xué)試劑，均為分析純；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

UV-2450紫外分光光度計(jì),日本島津公司；ZEN3690馬爾文激光粒度儀,英國馬爾文儀器公司；Bio-Rad電泳儀,伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；JSM-6510LV鎢燈絲掃描電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社(JEOL)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 酸肉制備及處理

新鮮豬肉，洗凈瀝干，切成約3 cm×5 cm×0.5 cm薄片，按m(原料肉)∶m(米粉)∶m(食鹽)=85∶10∶5加入配料，揉制數(shù)分鐘裝壇，并用新鮮粽葉壓緊塞住發(fā)酵壇口，倒置，水密封，后于20～25 ℃發(fā)酵。分別于發(fā)酵第0，20，50，80，110，140，180天取樣分析。

1.4.2 非蛋白氮的測定

參照廖定容[10]的方法，刷掉附在酸肉表面的米粉并剔除可見脂肪和筋膜，稱取絞碎的肉樣10 g于錐形瓶中，加入90 mL蒸餾水，室溫振搖40 min，過濾后取25 mL濾液，加入25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的TCA溶液。再次過濾后取10 mL濾液消化，采用凱氏定氮法測定非蛋白氮含量。

1.4.3 蛋白質(zhì)組成分析

(1)蛋白質(zhì)組成：參照SUN等[11]的方法。稱取絞碎肉樣4 g，加入10倍提取液A(15.6 mmol/L Na2HPO4，3.5 mmol/L KH2PO4)，冰浴中以10 000 r/min高速勻漿1 min，接著將勻漿液冷凍離心(7 500×g，15 min)，該步驟重復(fù)2次，收集上清液和沉淀。①上清液部分：加入50%TCA使上清液TCA終濃度為10%，以7 500×g冷凍離心15 min，所得沉淀為肌漿蛋白。②沉淀部分：加入10倍提取液B(0.45 mmol/L KCl，15.6 mmol/L Na2HPO4，3.5 mmol/L KH2PO4)，以10 000 r/min勻漿1 min，將勻漿液離心(7 500×g，15 min)，此提取步驟重復(fù)1次，合并上清液，即得肌原纖維蛋白。此次得到的沉淀作如下處理：用10倍體積的0.1 mol/L NaOH振蕩提取4 h，離心，上清液為堿溶蛋白，沉淀為肌基質(zhì)蛋白。堿溶蛋白和肌原纖維蛋白含量采用雙縮脲法測定，肌漿蛋白和肌基質(zhì)蛋白經(jīng)凍干后采用凱氏定氮法測定。

(2)蛋白質(zhì)SDS-PAGE：按SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說明配制10%的分離膠，5%的濃縮膠。電泳測試條件：剛開始采用15 mA恒流，至分離膠時(shí)換成25 mA恒流，當(dāng)溴酚藍(lán)指示條帶靠近分離膠底部時(shí)立刻終止操作。取下電泳膠塊，放入染色液[0.25%考馬斯亮藍(lán)，V(甲醇)∶V(冰醋酸)∶V(蒸餾水)=45∶10∶45]中染色1 h，隨后轉(zhuǎn)入脫色液[V(甲醇)∶V(冰醋酸)∶V(蒸餾水)=25∶10∶65]中搖床脫色至凝膠底色脫盡。

1.4.4 蛋白質(zhì)聚集分析

(1)蛋白質(zhì)濁度：肌漿蛋白濁度測定參照吳滿剛[12]的方法，肌原纖維蛋白質(zhì)濁度參照許艷順[13]的方法。先將蛋白用1.4.2對應(yīng)的提取液稀釋至1 mg/mL，肌漿蛋白做如下處理：在25 ℃放置20 min后，340 nm處測定吸光度。肌原纖維蛋白處理如下：取1 mL肌原纖維蛋白溶液(1 mg/mL)加入4 mL內(nèi)含不同濃度尿素(0、1.875、10 mol/L) 的0.6 mol/L NaCl溶液，調(diào)整其最終濃度為0.2 mg/mL，尿素濃度分別為0、1.5、8 mol/L。渦旋混合均勻后，室溫靜置15 min，分別于350 nm處測定吸光值(OD350)。

(2)蛋白質(zhì)粒徑：參考李學(xué)鵬等[14]的方法。采用馬爾文激光粒度儀測定肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和堿溶蛋白的粒徑。提取的各種蛋白溶液磁力攪拌30 min后用4層紗布過濾除去不溶性物質(zhì)，將蛋白質(zhì)濃度調(diào)整至5 mg/L。參數(shù)設(shè)定：掃描角度90 ℃，溫度25 ℃。

1.4.5 肌肉微觀結(jié)構(gòu)觀察

參考WATTANACHANT等[15]的方法制樣并略作修改。將肉樣切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的規(guī)格，在含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛的磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH=7.2)中4 ℃固定24 h，再將樣品切成2 mm×2 mm×2 mm的規(guī)格，接著用磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH=7.2)清洗，再接著用30%，50%，70%，80%，95%，100%乙醇逐級脫水(每級1 h)。經(jīng)液氮冷凍后放入冷凍干燥機(jī)中干燥，將干燥樣品噴金，掃描電鏡下觀察結(jié)果。

1.4.6 蛋白質(zhì)體外消化率

參照LI等[16]的方法并略微修改，用消化后的蛋白質(zhì)含量占消化前蛋白質(zhì)含量的百分比表示。胃蛋白酶消化率處理如下：準(zhǔn)確稱取肉樣(2.0 g)，加入8 mL PBS(10 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4，pH 7.0)并在4 ℃下均質(zhì)(2×30 s，9 500×g；2×30 s，13 500×g)，用1 mol/L HCl將勻漿液pH值調(diào)至2.0，并以1∶31.25的質(zhì)量比(以肉樣為質(zhì)量基位)添加胃蛋白酶，混合反應(yīng)液于37 ℃恒溫水浴2 h(每隔10 min搖勻1次)，然后用1 mol/L NaOH將pH值調(diào)至7.5以滅酶結(jié)束反應(yīng)。胃蛋白酶+胰蛋白酶體外消化率處理如下：在前述胃蛋白酶消化基礎(chǔ)上，接著再以1∶50的質(zhì)量比(以肉樣為質(zhì)量基位)添加胰蛋白酶，繼續(xù)將混合物于37 ℃水浴反應(yīng)2 h，接著用95 ℃水浴加熱5 min滅酶終止反應(yīng)。加入3倍體積的乙醇以沉淀反應(yīng)體系中未被消化的蛋白質(zhì)，4 ℃放置12 h后于4 ℃條件下以10 000×g離心20 min，棄上清，將沉淀中的乙醇揮發(fā)完全，采用凱氏定氮法測定沉淀的蛋白含量。按下列公式計(jì)算蛋白消化率：

式中：W0為未消化的蛋白質(zhì)含量；W1為經(jīng)酶消化后的蛋白質(zhì)含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 8.6作圖，SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)性分析。p<0.01表示極顯著，p<0.05表示顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中非蛋白氮(NPN)含量的變化

如圖1所示，發(fā)酵0～80 d期間NPN含量不斷增長(p<0.05)，由13.96 mg/g上升至23.25 mg/g，隨著發(fā)酵的繼續(xù)NPN含量則繼續(xù)緩慢增加，說明發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)一直處于被水解狀態(tài)。該變化趨勢與馬艷梅等[17]對火腿的研究、HU等[18]對魚糜、香腸的研究結(jié)果相似。有研究報(bào)道，NPN的含量發(fā)生變化可能是由一些微生物或內(nèi)源性蛋白酶將蛋白氮轉(zhuǎn)變?yōu)镹PN造成的，也可能是環(huán)境中較低的pH值誘導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而促進(jìn)NPN含量升高[19]。

圖1 發(fā)酵過程中非蛋白氮含量的變化Fig.1 Changes in non-protein nitrogen content during fermentation

2.2 酸肉發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的變化

2.2.1 酸肉發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)組成變化

不同發(fā)酵時(shí)段酸肉的蛋白組成變化如圖2，發(fā)酵0 d時(shí)肌原纖維蛋白含量最高，約占總蛋白的60.45%，其次是肌漿蛋白約占35.68%，而堿溶蛋白和肌基質(zhì)蛋白含量相對較少，分別約占總蛋白的4.8%和2.3%。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量顯著降低，而堿溶蛋白顯著增加(p<0.05)，特別是發(fā)酵前期20 d的含量變化最為明顯，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白分別降至發(fā)酵0 d時(shí)的59.28%和58.20%，堿溶蛋白增至發(fā)酵0 d的6.92倍；發(fā)酵180 d時(shí)，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白分別為發(fā)酵0 d時(shí)的27.21%和21.19%，堿溶蛋白為發(fā)酵0 d時(shí)的8.76倍，而肌基質(zhì)蛋白含量在整個(gè)發(fā)酵過程中變化不大。肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量的減少可能與發(fā)酵過程中pH值降低(產(chǎn)酸)導(dǎo)致其發(fā)生變性聚集[20-21]，使其鹽溶性下降而變成了可溶于堿性溶液的蛋白有關(guān)。其次，在肌肉內(nèi)源酶和微生物胞外酶共同作用下發(fā)生降解，生成了肽和游離氨基酸等物質(zhì)。該變化趨勢與孫為正[22]、VISESSANGUAN等[23]、許艷順等[13]對相關(guān)發(fā)酵肉制品的研究報(bào)道相似。

圖2 酸肉蛋白質(zhì)組成在發(fā)酵中的變化Fig.2 Changes in protein composition of sour meat during fermentation

2.2.2 不同發(fā)酵時(shí)段酸肉蛋白SDS-PAGE電泳分析

SDS-PAGE結(jié)果如圖3。從肌漿蛋白電泳圖譜(A)可知，發(fā)酵0 d肌漿蛋白分子量主要分布在14～180 kDa之間。具體來說，20 d時(shí)約100、63 kDa蛋白條帶消失；發(fā)酵20、50和80 d時(shí)，48、45和30 kDa的蛋白條帶無明顯變化，但相對0 d均變得很淺，而在110 d后，這些蛋白條帶幾乎完全消失；14.4～25 kDa蛋白條帶均在發(fā)酵80 d后消失；約66.2 kDa和60 kDa附近的蛋白條帶無明顯變化。值得注意的是，在發(fā)酵0 d時(shí)約30～35 kDa有4條蛋白條細(xì)帶，發(fā)酵20 d變?yōu)?條寬帶，110 d后只剩下一條顏色較深的寬帶，推測可能由于發(fā)酵產(chǎn)酸導(dǎo)致該區(qū)間的蛋白質(zhì)變性聚集或是發(fā)生持續(xù)降解所致。總之，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，肌漿蛋白電泳圖出現(xiàn)蛋白條帶逐漸變淺或消失，說明了肌漿蛋白發(fā)生了降解或變性聚集，也說明了其含量不斷降低。

圖3 酸肉各蛋白組分電泳圖Fig.3 SDS-PAGE electrophoretograms of sarcoplacmicproteins(A), myofibrillar proteins(B), alkali-soluble proteins(C)

肌原纖維蛋白的特征條帶可歸屬為肌球蛋白重鏈(MHC，200 kDa)、α-輔助激動(dòng)蛋白(94 kDa)，原肌球蛋白(80 kDa)、肌鈣蛋白(75 kDa)，肌動(dòng)蛋白(45 kDa)、肌球輕鏈(20 kDa)。由肌原纖維蛋白電泳圖(圖3-B)看出，與0 d相比，發(fā)酵20 d時(shí)MHC和肌動(dòng)蛋白條帶明顯變細(xì)且顏色變淺，50 d時(shí)基本消失，說明MHC和肌動(dòng)蛋白在發(fā)酵過程中其含量在不斷減少；約66.2～180 kDa區(qū)域的蛋白條帶在20～80 d時(shí)有的顏色變淺，有的發(fā)生消失并在附近生成了新的條帶，而在110 d后則變成色深、帶寬而清晰的3條蛋白條帶(116、75和66.2 kDa)。63 kDa處的條帶顏色先加深，110 d時(shí)再次加深，說明其是肌原纖維蛋白中大分子蛋白的主要降解產(chǎn)物之一。約35 kDa處蛋白條帶在發(fā)酵20 d后顏色加深，50 d后變成了帶寬而色深的蛋白條帶，并發(fā)現(xiàn)其在整個(gè)發(fā)酵階段的變化趨勢與肌動(dòng)蛋白相反，因此推斷肌動(dòng)蛋白可能降解成了約35 kDa的蛋白質(zhì)分子。其他一些發(fā)酵肉制品的肌原纖維電泳圖譜均顯示MHC和肌動(dòng)蛋白條帶逐漸變淺至消失的現(xiàn)象[22]。對酸肉而言，最有可能是乳酸菌產(chǎn)酸和添加的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%食鹽的滲透直接或間接影響蛋白質(zhì)降解或變性所致，如張平等[24]研究發(fā)現(xiàn)，食鹽能促進(jìn)大分子蛋白(>180kDa)降解，且在貯藏后期也發(fā)現(xiàn)許多蛋白條帶的消失現(xiàn)象。此外，從整體看，各發(fā)酵時(shí)段蛋白條帶變化明顯，其中50、80 d的條帶較相似，110、140、180 d圖譜基本一致，尤其發(fā)酵110 d后出現(xiàn)許多蛋白條帶的消失并生成寬而深的條帶，可能由于肌原纖維蛋白進(jìn)一步降解，同時(shí)部分小分子蛋白重新聚合而成大分子蛋白引起的。此外，也可能由于此時(shí)蛋白嚴(yán)重變性引起溶解度改變，導(dǎo)致某些分子量蛋白不易被提取出來。

堿溶性蛋白電泳圖(圖3-C)顯示其最初主要是由200 kDa和45 kDa構(gòu)成。發(fā)酵20 d后，這2種蛋白條帶顏色明顯減弱直至消失，說明此時(shí)堿溶性蛋白發(fā)生了一定程度的降解。與此同時(shí)，約135、35、30 kDa有新條帶產(chǎn)生。同樣，14.4 kDa處有新條帶生成，說明堿溶性蛋白中的大分子降解產(chǎn)生了一些小分子蛋白片段。此外，高于245 kDa區(qū)域內(nèi)的蛋白片段在發(fā)酵80 d時(shí)明顯增多，可能由于部分蛋白通過自由基鍵合作用，相互連接生成了大分子蛋白聚集體而堆積在分離膠頂部[25]。此外，堿溶性蛋白的部分條帶如200、45kDa處的條帶與肌原纖維蛋白的變化有一定相似性，說明肌原纖維蛋白變性是引起堿溶性蛋白含量上升的原因之一。

2.3 酸肉發(fā)酵過程中的蛋白質(zhì)聚集情況分析

2.3.1 蛋白質(zhì)濁度的變化

蛋白質(zhì)濁度在一定程度上可以反映蛋白質(zhì)的聚集情況，其值越大，說明聚集程度越大。由圖4可知，肌漿蛋白吸光值在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)波動(dòng)上升的趨勢，可能的原因是肌漿蛋白在發(fā)酵過程中存在不斷聚合以及聚合蛋白體又被解離降解有關(guān)。而其他發(fā)酵階段的肌漿蛋白的濁度值均高于0 d時(shí)，說明其結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，這可能與疏水基團(tuán)過度暴露，蛋白發(fā)生疏水聚集有關(guān)[12]。

圖4 發(fā)酵過程中肌漿蛋白濁度的變化Fig.4 Changes in turbidity of sarcoplasmic protein during fermentation

1.5 mol/L的尿素(urea)能夠打破分子間或分子內(nèi)的氫鍵，8 mol/L的尿素則能夠打破氫鍵及破壞疏水作用。肌原纖維蛋白在含有不同濃度尿素的0.6 mol/L NaCl溶液中的濁度變化如圖5。在不含尿素的0.6 mol/L NaCl溶液中，肌原纖維蛋白濁度呈快速上升后保持穩(wěn)定略升的趨勢，在發(fā)酵110 d達(dá)峰值；在1.5 mol/L尿素溶液中呈逐漸增加后保持穩(wěn)定略降的趨勢，在發(fā)酵80 d時(shí)達(dá)峰值，但是其濁度值均低于在0.6 mol/L NaCl的濁度值；在濃度為8 mol/L尿素溶液中時(shí)，濁度值呈略降后緩慢上升趨勢，且各發(fā)酵階段的濁度值均低于低濃度尿素處理時(shí)的濁度，說明肌原纖維蛋白在NaCl溶液中濁度的增加與氫鍵和疏水作用有關(guān)，也說明發(fā)酵可使酸肉蛋白之間的疏水相互作用增強(qiáng)從而引起蛋白發(fā)生疏水聚集。該結(jié)果與許艷順[13]報(bào)道類似。

圖5 發(fā)酵過程中肌原纖維蛋白濁度的變化Fig.5 Changes in turbidity of myofibrillar proteins during fermentation

2.3.2 蛋白質(zhì)粒徑的變化

各發(fā)酵時(shí)段蛋白組分平均粒徑變化如表1。與發(fā)酵0 d相比，肌漿蛋白平均粒徑顯著增加(p<0.05)，發(fā)酵180 d時(shí)粒徑為發(fā)酵0 d的2.99倍，峰值粒徑出現(xiàn)在發(fā)酵110 d。肌原纖維蛋白在發(fā)酵中粒徑呈波動(dòng)變化，峰值粒徑出現(xiàn)在發(fā)酵180 d，為發(fā)酵0 d的1.24倍。堿溶性蛋白平均粒徑呈先快速增加后波動(dòng)變化。這說明發(fā)酵后酸肉蛋白發(fā)生變性導(dǎo)致蛋白聚集體形成，也印證了濁度增加的原因。而各種波動(dòng)性的變化主要與蛋白質(zhì)降解、蛋白聚集體的不斷形成和解離有關(guān)。這些變化最終都會(huì)導(dǎo)致酸肉微觀結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)營養(yǎng)特性發(fā)生改變。

表1 發(fā)酵過程中酸肉蛋白平均粒徑的變化單位：nm

注：結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=3，同一行數(shù)據(jù)不同字母表示顯著性差異(p<0.05)；ND表示未檢出。

2.4 發(fā)酵酸肉微觀結(jié)構(gòu)變化

觀察酸肉SEM結(jié)果可知(圖6)，發(fā)酵0 d時(shí)肌纖維束結(jié)構(gòu)完整、排列緊密、肌束間界限分明且空隙較小、紋理清晰。

A-G依次代表發(fā)酵0，20，50，80,110,140,180 d樣品圖；箭頭a-肌纖維束；箭頭b-肌束間隙圖6 不同發(fā)酵時(shí)段酸肉的橫截面微觀結(jié)構(gòu)圖(×250倍)Fig.6 SEM of sour meat during different fermentation time

發(fā)酵20 d時(shí)，酸肉組織結(jié)構(gòu)完整性遭到輕度破壞、肌纖維明顯收縮、結(jié)構(gòu)開始變得疏松、肌內(nèi)膜開始破裂、肌束間隙略微增大。發(fā)酵20～80 d,肌纖維排列更加混亂、肌束間隙更加明顯、肌纖維邊界更加模糊并伴有明顯的斷裂等。發(fā)酵80 d之后，可能由于蛋白的進(jìn)一步降解及凝膠化加劇，導(dǎo)致肌束膜被嚴(yán)重破壞，進(jìn)而導(dǎo)致部分肌纖維束發(fā)生崩塌使它們相互黏成一塊，肌肉橫截面紋理也變得很不規(guī)則。其中，肌內(nèi)膜有保持肌肉的完整性、阻止肌纖維遭到損傷的作用，其破裂可導(dǎo)致致密的結(jié)構(gòu)破損和營養(yǎng)成分的流失。樊明明[26]報(bào)道發(fā)酵后的肉脯肌原纖維結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，認(rèn)為是發(fā)酵劑分泌的蛋白酶促進(jìn)了肌纖維間連接蛋白和小蛋白水解所致，并推測如果發(fā)酵繼續(xù)，肉脯蛋白會(huì)進(jìn)一步水解，纖維間的間隙和空洞會(huì)變得更大。

2.5 發(fā)酵時(shí)長對酸肉蛋白質(zhì)體外消化率的影響

不同發(fā)酵時(shí)段酸肉蛋白質(zhì)的體外消化率如圖7。無論是單獨(dú)使用胃蛋白酶還是胃蛋白結(jié)合胰蛋白酶處理，消化率均高于發(fā)酵0 d，說明發(fā)酵能夠在一定程度上促進(jìn)蛋白質(zhì)消化性提高。單獨(dú)使用胃蛋白酶時(shí)，發(fā)酵前50 d蛋白消化率顯著升高(p<0.05)并于50 d達(dá)到峰值，但隨著發(fā)酵時(shí)間延長，消化率逐漸下降，其中發(fā)酵50～110 d消化率無顯著性差異(p>0.05)。采用胃蛋白酶+胰蛋白酶消化時(shí)，各階段消化率差異顯著(p<0.05)，在發(fā)酵前80 d蛋白質(zhì)消化率顯著升高，隨著發(fā)酵的繼續(xù)，消化率略微下降。這些結(jié)果表明，發(fā)酵明顯影響了肌肉蛋白對消化酶的水解敏感性，發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)適度變性使其暴露出更多消化酶作用位點(diǎn)，從而促進(jìn)消化率提高。長時(shí)間發(fā)酵可能由于蛋白質(zhì)較高水平的氧化和聚集，消化酶作用位點(diǎn)被掩埋導(dǎo)致消化率降低[27]。此外，胃蛋白酶和胰蛋白酶都有固定的作用位點(diǎn)，當(dāng)作用位點(diǎn)的氨基酸被氧化后，消化率下降[6]。

圖7 不同發(fā)酵保藏時(shí)段酸肉蛋白質(zhì)的消化率變化Fig.7 Changes in vitro digestibility of sour meat protein during fermentation注：不同小寫字母表示胃蛋白酶體外消化率差異顯著；不同大寫字母表示胃蛋白酶+胰蛋白酶體外消化率差異顯著(p<0.05)。

2.6 蛋白質(zhì)變化及與體外消化率的相關(guān)性分析

由表2可知，蛋白組分間均呈較好的相關(guān)性(p<0.01)。其中肌漿蛋白、肌原纖維蛋白與堿溶性蛋白呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01)，表明發(fā)酵后酸肉中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白部分發(fā)生變性，進(jìn)而生成堿溶性蛋白。由體外消化率與蛋白組分相關(guān)性分析可知，胃蛋白酶體外消化率與堿溶性蛋白存在極顯著正相關(guān)(p<0.01)，而胃蛋白酶+胰蛋白酶體外消化率與肌漿蛋白、肌原纖維蛋白、堿溶性蛋白極顯著相關(guān)(p<0.01)。通常認(rèn)為蛋白質(zhì)適度變性和降解可在一定程度上促進(jìn)產(chǎn)品消化率和較好滋味的形成，但過度氧化聚集或降解則會(huì)對消化率或滋味等品質(zhì)產(chǎn)生消極影響，如大量小肽的累積反而會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品滋味變差[28]。

表2 發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的變化及與消化性的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between changes of proteinand digestion during fermentation

注：*表示相關(guān)性在 0.05 水平上顯著(雙側(cè))；**表示相關(guān)性在 0.01 水平上顯著(雙側(cè))。SP：肌漿蛋白；MP：肌原纖維蛋白；JR：堿溶蛋白；JZ：肌基質(zhì)蛋白；PD1：胃蛋白酶消化率；PD2：胃蛋白酶+胰蛋白酶消化率。

3 結(jié)論

本文研究了酸豬肉在長時(shí)間發(fā)酵中蛋白質(zhì)降解及聚集變化，以及肌肉微觀結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)體外消化情況，發(fā)現(xiàn)長時(shí)間發(fā)酵使蛋白組分顯著變化，其中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量均隨發(fā)酵時(shí)間延長不斷減少，堿溶性蛋白則不斷增加并在發(fā)酵20 d時(shí)成為酸肉中主要的蛋白組成分，同時(shí)非蛋白氮含量呈不斷增長趨勢。SDS-PAGE圖譜顯示，隨著發(fā)酵進(jìn)行，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的蛋白條帶數(shù)不斷減少或直至消失，尤其發(fā)酵110 d后條帶數(shù)最少，但有寬而深的條帶產(chǎn)生，說明發(fā)酵過程中蛋白不斷發(fā)生降解并可能有蛋白聚集體形成。堿溶蛋白某些蛋白條帶變化趨勢與肌原纖維蛋白相似，說明肌原纖維蛋白變性是導(dǎo)致堿溶性蛋白含量增加的主要原因。發(fā)酵20 d后肌漿蛋白和肌原纖維蛋白濁度增加，兩者及堿溶蛋白平均粒徑也有所增加并在發(fā)酵過程中呈波動(dòng)變化，說明蛋白在發(fā)酵過程中發(fā)生了聚集，但聚集體又不斷被分解。這些結(jié)果表明，發(fā)酵過程中蛋白的變性聚集并未阻止蛋白的持續(xù)降解。肌肉微觀結(jié)構(gòu)顯示，肌原纖維結(jié)構(gòu)完整性明顯受到破壞，尤其到中期后可能由于蛋白的進(jìn)一步降解及凝膠化加劇，導(dǎo)致肌束膜被嚴(yán)重破壞。此外，體外消化實(shí)驗(yàn)顯示發(fā)酵在一定程度上促進(jìn)蛋白質(zhì)消化率，但在發(fā)酵后期，可能由于大量蛋白聚集體的形成淹沒了蛋白酶作用位點(diǎn)，導(dǎo)致體外消化率降低，表明長時(shí)間發(fā)酵保藏酸肉可影響蛋白質(zhì)消化率。從本研究結(jié)果觀察酸肉以發(fā)酵50～80 d為宜。