基于檸檬酸鹽與次黃嘌呤偶合添加的環磷酸腺苷發酵工藝

李志剛，陳寶峰，方智博，張中華，常景玲*

1(現代生物育種河南省協同創新中心，河南 新鄉，453003) 2(河南科技學院 生命科技學院，河南 新鄉，453003)

環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)是人體內廣泛存在的一種生理活性物質，作為細胞內的第二信使，對糖代謝、脂肪代謝以及核酸和蛋白質合成等具有重要的調節作用[1]。該物質作為藥物和飼料添加劑廣泛應用于心血管類疾病的治療和畜禽產品的生產中，具有十分重要的應用價值[2]。

微生物發酵生產cAMP的方法具有反應條件溫和、成本低、環境友好等優點，具有良好的工業化生產前景，受到越來越多的關注[3]。然而，微生物合成cAMP的過程存在兩個主要問題，制約著其發酵性能的提高。一方面，cAMP是由ATP在腺苷酸環化酶的催化下直接環化形成的，ATP不僅是合成產物的原料，還要為細胞生長以及蛋白質、核酸、脂肪等的合成提供能量[4]，cAMP合成也常常受到能量供應制約。另一方面，由從頭合成途徑合成嘌呤環的過程要經過10步反應，消耗5分子的ATP，代謝過程復雜而且加劇了ATP供應不足的問題。

檸檬酸鹽是一種常見的化學試劑，價格低廉，在微生物代謝中具有重要的調節作用。該物質可以抑制磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活性，減少有機酸的合成，調節糖酵解途徑與磷酸戊糖途徑的代謝流，促進肌苷、尿苷酸等物質的合成[5-6]。更重要的是，檸檬酸鹽作為輔助能量物質可以刺激以NAD+為輔酶的代謝反應，加快NAD+合成NADH的過程，再通過電子呼吸鏈大量合成ATP[7-8]。另外，微生物的補救途徑[9]可以直接利用現成的嘌呤類物質與PRPP一步反應即可合成肌苷酸，進而合成cAMP，相比于從頭合成途徑代謝效率得以提高，同時降低了ATP的消耗，這種合成方法具有明顯的優勢[10]。

該研究針對cAMP發酵過程中能量供應不足的問題，試圖將檸檬酸鹽的作用與補救途徑的優勢相結合促進cAMP的合成，提出了檸檬酸鹽與次黃嘌呤偶聯添加發酵工藝，提高發酵性能。

1 材料與方法

1.1 菌種

本實驗室篩選并保藏的節桿菌(Arthrobactersp.A. sp01)。該菌株已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO. M2013431。

1.2 培養基及配制方法

斜面培養基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 3，尿素4，瓊脂20，調pH值至7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

種子培養基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 3，尿素4，酵母膏10，調pH值至7.2，121 ℃、高壓蒸汽滅菌20 min。

發酵培養基(g/L)：葡萄糖50，K2HPO410，KH2PO410，尿素10，生物素0.005，CoCl20.01，蛋白胨5，次黃嘌呤2，調pH值至7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3 培養方法

搖瓶培養：30 mL發酵培養基裝入250 mL錐形瓶，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。接入培養24 h種子液，接種量為10%體積百分濃度。接種后放入搖床培養72 h，培養溫度30 ℃、轉速220 r/min。

發酵罐培養：7 L機械攪拌式發酵罐(上海保興生物設備有限公司BIOTECH-7BG)配備pH和DO電極各一支(瑞士METTLER TOLEDO公司)，裝載發酵培養基5 L(初始葡萄糖濃度為80 g/L)。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，接種量10%，發酵溫度30 ℃，pH值控制在6.8，攪拌轉速初始400 r/min，視溶氧變化情況逐漸增加至600 r/min，通風量從起始的0.1 vvm提升至0.6 vvm。

次黃嘌呤添加方法：分批發酵進行至27 h和40 h，分別脈沖式添加次黃嘌呤，每次添加量1 g/L-broth(發酵液中次黃嘌呤濃度提高1 g/L)。

檸檬酸鈉添加方法：

(a)發酵罐實驗，發酵進行至24 h一次性添加3 g/L-broth的檸檬酸鈉。

(b)搖瓶實驗，設置1、2、3、4和5 g/L-broth 5個不同的濃度梯度和0、18、30和42 h 4個不同的添加時間，共計20個不同組合，每個組合做3個平行試驗。

1.4 分析方法

菌體濃度測定：采用光密度法測定。發酵液稀釋20倍，用600 nm波長下的OD值表示菌體濃度。

菌體干重測定：參見文獻[11]，最終得到菌體干重與OD600的關系為：DCW/(g·L-1)=0.46×OD600

葡萄糖濃度測定：采用DNS法進行測定。

cAMP與次黃嘌呤測定：使用高效液相色譜(安捷倫1026)進行測定[12]。

ATP與ADP測定方法：取5 mL發酵液，4 ℃、9 000 r/min冷凍離心10 min獲得菌體，液氮中處理1 min，使胞內代謝瞬間停止。將菌體用PBS緩沖液洗滌2次，重新懸浮在5 mL的PBS緩沖液中，冰浴條件下超聲波破碎10 min，超聲3 s，靜置5 s，經4 ℃、10 000 r/min離心后，上清液用0.22 μm膜過濾后使用液相色譜分析。色譜條件：Lichrospher C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫30 ℃；水相(6.8 g KH2PO4和3.2 g四丁基溴化銨溶解于水并定容至1 L，用H3PO4調pH至4.3)，水相∶乙腈為85∶15(體積比)，流量0.8 mL/min；檢測波長258 nm。

2 結果與討論

2.1 檸檬酸鈉最佳添加時間與添加量的確定

研究表明，檸檬酸鹽能改變糖酵解與磷酸戊糖途徑的碳流量分配比例并可以作為輔助能源使用提高細胞產能水平，有利于核苷類物質的合成[5-6]。在250 mL錐形瓶中進行了添加檸檬酸鈉的cAMP發酵試驗，共設置5個濃度梯度和4個不同添加時間，以cAMP產量為主要指標確定最佳添加時間和添加量。如表1所示，30 h添加3 g/L-broth檸檬酸鈉時產物濃度達到最高的2.67 g/L，比對照提高了54.3%。

表1 檸檬酸鈉添加時間和添加量對cAMP發酵產物的影響Table 1 The effects of citrate sodium on cAMP productionwith different addition time and amounts

注：表中數據單位為g/L。

2.2 添加檸檬酸鈉提高cAMP發酵的整體性能

根據搖瓶實驗結果并充分考慮發酵罐培養溶氧效果好、菌體生長快的特點，在7 L發酵罐上進行了添加檸檬酸鈉的發酵實驗，檸檬酸鈉的添加時間為24 h，添加量為3 g/L-broth。圖1將對照批次與添加檸檬酸的批次的主要參數進行了比較。如圖1(A, B)所示，添加檸檬酸鈉批次的cAMP濃度在發酵50 h時達到最大值3.68 g/L，而對照批次發酵72 h時cAMP濃度為3.32 g/L；產量僅提高了11.2%，然而由于發酵時間縮短了22 h，生產效率提高了60.2%。此外，檸檬酸鈉添加提高了菌體濃度、葡萄糖消耗以及cAMP合成速率，如圖1-A、圖1-C和圖1-D所示。值得注意的是，次黃嘌呤在發酵前期快速消耗，至發酵27 h時降至0.4 g/L以下，不再變化(圖1-B)。

這表明發酵進行至27 h后，cAMP是由從頭合成途徑合成并積累的，檸檬酸鈉添加顯著提高了從頭合成途徑的代謝通量，促進了產物的快速合成。

2.3 檸檬酸鈉添加促進ATP合成提高ATP/ADP比

研究表明檸檬酸鹽可以促進能量代謝，是一種有效的輔助能量物質[7]。對上述2個發酵批次不同時期的胞內ATP和ADP含量進行了測定，結果見圖2。

A：■/□菌體濃度，●/○葡萄糖濃度；B：▲/△ cAMP濃度，◆/◇次黃嘌呤濃度；黑色符號：對照批次；白色符號：24 h添加3 g/L-broth檸檬酸鈉；C、D：——對照批次；---24 h添加3 g/L-broth檸檬酸鈉；↓表示檸檬酸添加時間圖1 檸檬酸鈉添加對菌體生長、殘糖、產物合成及前體利用的影響Fig.1 The effects of citrate sodium on cAMP fermentation performance

添加檸檬酸鈉批次的胞內ATP含量得到顯著提高，ATP/ADP比率也大幅提高；尤其在24 h后，ATP含量和ATP/ADP比率迅速上升，至40 h左右達到最高點，此時正是cAMP快速合成、葡萄糖快速消耗的時期。這表明檸檬酸鈉促進了ATP的合成，為cAMP的合成提供了充足的原料。

●-對照；○-24 h添加3 g/L-broth檸檬酸鈉圖2 檸檬酸鈉添加對ATP合成及ATP/ADP比的影響Fig.2 The effects of citrate sodium on ATP synthesis and ATP/ADP ratio

2.4 脈沖式補充次黃嘌呤偶合檸檬酸鈉添加的cAMP發酵工藝的整體性能

除從頭合成途徑外，微生物還可以直接利用環境中現有的嘌呤類物質合成肌苷酸(補救途徑)，進而合成cAMP。補救途徑通過一步反應即可完成從頭合成途徑的10步反應，節省了5分子ATP，代謝過程效率更高。希望將補救途徑的優勢與檸檬酸鈉的作用相結合，進一步提高cAMP的生產效率。因此，進行了脈沖式補充次黃嘌呤偶合檸檬酸鈉添加的cAMP發酵試驗。如圖3所示，偶合添加檸檬酸鈉批次的菌體濃度和cAMP產量均明顯提高，cAMP濃度在50 h達到最大的4.42 g/L，生產效率達到0.088 g/(L·h)，與單獨添加次黃嘌呤批次相比分別提高了38.1%和40.2%，大大提高了補救途徑的運行效率。

另外，由圖3B中次黃嘌呤濃度的變化情況也表明添加檸檬酸鈉確實促進了次黃嘌呤的吸收，提高了次黃嘌呤的利用效率。

■/□：菌體濃度；●/○：葡萄糖濃度；▲/△：cAMP濃度；◆/◇：次黃嘌呤濃度；黑色符號：27、38 h各補充g/L-broth次黃嘌呤；白色符號：24 h添加3 g/L-broth檸檬酸鈉，27、38 h各補充1 g/L-broth次黃嘌呤圖3 檸檬酸鈉與次黃嘌呤偶聯添加工藝中菌體、殘糖、產物及前體濃度的變化情況Fig.3 The fermentation performance for cAMP production with citrate sodium and hypoxanthine addition

2.5 不同發酵模式下主要發酵參數比較

表2對不同工藝條件下各發酵批次的主要參數進行了比較。如表2所示，添加檸檬酸鈉或次黃嘌呤批次的發酵周期均不同程度的縮短，cAMP產量和發酵強度均不同程度的提高；24 h加檸檬酸鈉并脈沖補充次黃嘌呤批次的cAMP產量為4.42 g/L，發酵強度達到0.088 g/(L·h)，比對照分別提高了33.1%和91.3%。所有添加檸檬酸批次的cAMP產量、發酵強度均有一定程度的提高，特別是同時補充次黃嘌呤的批次提高幅度更大，使檸檬酸鈉的作用與補救途徑優勢同時得到發揮。

表2 不同發酵批次的性能參數比較Table 2 Performance comparison for different fermentation modes

注：HX代表添加次黃嘌呤，C代表添加檸檬酸鈉；24 h表示添加檸檬酸鈉的時間；次黃嘌呤添加方式：27、38 h各補充1 g/L-broth次黃嘌呤

3 結論

添加檸檬酸鈉有利于提高cAMP發酵的整體性能，24 h一次性添加3 g/L-broth的檸檬酸鈉，cAMP濃度和生產效率分別比對照提高了11.2%和60.2%；對胞內能量物質含量進行分析，結果表明添加檸檬酸鈉顯著提高了ATP含量和ATP/ADP比率，為cAMP合成提供了能量和物質保障。提出了添加檸檬酸鈉偶合脈沖補充次黃嘌呤(前體)的發酵工藝，將能量供給與補救途徑的優勢相結合，cAMP產量和發酵強度分別比對照提高了33.1%和91.3%。