超長凍藏時間對牛肉品質的影響

趙晶，張婷，劉永峰，楊曉

(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安，710119)

牛肉因具有高蛋白、低脂肪、豐富的礦物質等營養價值而備受消費者青睞[1-2]。我國的牛肉及其肉制品的消費量和出口量逐年上升[3]，凍藏依然是牛肉長期貯藏或運輸的主要存在方式，然而凍藏短時間內可抑制微生物及酶對牛肉品質的影響，由于外界環境和內部生化因子及其相互作用的影響，牛肉的品質隨凍藏時間的延長而劣變。2015年的“僵尸肉”事件引起了中國食品安全危機[4-5]，肉凍藏時間越長其營養和美味均降低，保存時間不要超過3個月[6]，所以了解牛肉隨凍藏時間延長的品質具體變化及判定牛肉凍藏時間對科研和生產具有重要意義。凍結和凍藏過程中，肌細胞間的冰晶和肌細胞內的冰晶的不斷長大，對肌細胞不斷擠壓造成機械損傷使其保水性降低[7-8]，蛋白質結合的水形成冰晶，隨凍藏時間延長逐漸升華使蛋白質脫水聚集變性，蛋白質內部的疏水集團移動到表面使其溶解性降低、膠體性質降低。AROEIRA等[9]研究發現在凍藏條件下牛肉色澤穩定性降低。MUELA等[10]研究牛肉宰后凍藏21個月的pH、色澤、保水性和脂質氧化，結果表明凍藏時間越長牛肉紅度和保水性降低、脂質氧化增加。牛力[11]通過對比不同凍結速率和不同凍藏溫度對雞肉品質的影響研究發現，凍結速率越大，解凍汁液流失率、蒸煮損失和脂質過氧化值(TBARS值)越小，凍藏溫度越低，總蛋白溶解度和解凍汁液流失率越小。廖彩虎等[12]研究發現-20 ℃、-30 ℃、-40 ℃三種凍藏溫度下雞肉的肌動蛋白、肌球蛋白和肌漿蛋白變性程度均隨凍藏時間的延長而顯著增大。食用冷凍肉或加工肉制品時均需將冷凍肉解凍，解凍次數和解凍方式均會對肉品品質產生影響[13-14]。余小領等[15]通過對比不同解凍速率對豬肉保水性和超微結構的影響研究，結果發現：在一定范圍內可能存在可使肉品解凍汁液流失率最低的最佳解凍速率；解凍速率對加壓系水力影響較小，而不同個體對加壓系水力影響較大；解凍速率越高對肉品超微結構破壞越嚴重。牛肉品質變化在不同凍藏溫度條件下和國標規定內的凍藏時間下的研究較多，但超長凍藏時間對牛肉品質的影響研究方面尚缺少數據。而且，通過建立牛肉營養、質構等品質指標與凍藏時間的數學模型，用于預測凍藏時間的研究更鮮有報道。因此，本研究以凍藏0、3、7、18、42和66個月的牛肉為試驗材料，研究牛肉的物性指標及營養品質指標隨凍藏時間延長的變化，以期建立牛肉品質、物性等指標與凍藏時間的模型來預測牛肉凍藏時間，從而將為牛肉凍藏時間的鑒別提供一定的理論基礎及依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

凍藏0、3、7、18、42和66個月的牛肉作為試驗組，將凍藏0、3、7個月的牛肉分別放置5個月(即凍藏時間為5、8、12個月)作為驗證組，牛肉均來自于3歲左右的健康秦川牛公牛的后部位肉(米龍、黃瓜條、和尚頭)，每個凍藏時間點各取100 g左右肉樣置于塑料自封袋中冷凍貯藏，解凍后進行一次性檢測。其中凍藏42和66個月的試驗材料由于水分升華和干耗導致表面有較厚的干肉層，所以凍藏42個月和66個月的試驗材料為去掉外部干肉的內層肉；凍藏0、3、5、7、8、12和18個月的牛肉樣品基本沒有干肉層，直接用于試驗。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

37種脂肪酸甲酯混標，美國Sigma公司；三氟化硼甲醇溶液(色譜級)，美國Sigma公司；甲醇(色譜級)、正己烷(色譜級)、95%乙醇等，天津市科密歐化學試劑有限公司；KCl、NaCl、MgCl2等試劑均為分析純，天津市天力化學試劑有限公司；甲基紅，天津市天新精細化工開發中心；次甲基藍，天津市天新精細化工開發中心。

1.2.2 主要儀器

QP2010氣相色譜-質譜聯用儀，日本島津公司；TA.XT.Plus 質構儀，英國stable micro system公司；NS800分光測色儀，深圳三恩馳科技有限公司；Kjeltec 2300全自動凱氏定氮儀，瑞典Foss公司；RE-52AA旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；JA2003N型電子天平，上海精密儀器有限公司；GDX-9073B-1型電熱鼓風干燥箱，上海福瑪實驗設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

將試驗組牛肉置于4 ℃冰箱中解凍10 h后進行指標測量。測量TPA、色澤和系水力指標的試驗材料為牛肉塊(約3 cm×3 cm×3 cm)，測量其他指標的試驗材料均是剔除了肌膜、脂肪、筋等的牛肉糜(約20 mm×20 mm×20 mm)。

1.3.2 牛肉TVB-N含量測定

參照國家標準GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛生標準的分析方法》，取(5.000 ± 0.003)g肉漿置于50 mL水中，振搖浸漬30 min后過濾，濾液置于4 ℃冰箱中備用。將加入混合指示劑和硼酸吸收液的錐形瓶置于冷凝管下端，取5 mL濾液和5 mL氧化鎂懸濁液于半微量凱氏定氮儀中加熱，從冷凝管管口開始出現第一滴冷凝水時開始計時，5 min后取出錐形瓶，用鹽酸溶液滴定至硼酸吸收液為紫色，滴定體積為V1(mL)，空白樣品滴定體積為V2(mL)。TVB-N含量計算公式如下，m(g)為牛肉糜質量，c(mol/L)為滴定鹽酸濃度，14為與1.00 mL鹽酸標準滴定溶液[c(HCl)=1.000 mol/L]或硫酸標準滴定溶液[c(1/2H2SO4)=1.000 mol/L]相當氮的質量，mg。

(1)

1.3.3 牛肉水分含量測定

參照國家標準GB/T 9695.152008《肉與肉制品水分含量測定》中的直接干燥法。

1.3.4 牛肉系水力測定

參照標準NY/T 8212004《豬肌肉品質測定技術規范》，將牛肉切成邊長為1.5 cm的方塊，將肉塊包裹上一層棉紗后記牛肉質量為m1(g)，上下各墊18層濾紙和一層硬紙板，于質構儀下加壓至35 kg并保持5 min，測量加壓后的牛肉塊質量記m2(g)，則牛肉失水重=m1-m2，牛肉系水力計算如下。

(2)

1.3.5 牛肉pH測定

參照標準GB/T 9695.5—2008《肉與肉制品pH測定》和胡耀華[16]方法，將4 g肉糜置于40 mL 0.1 mol/L KCl溶液中于室溫下振蕩搖晃30 min后測定。

1.3.6 牛肉TPA測定

將牛肉剪成1.5 cm3肉塊，采用質構儀TPA模式測定硬度、脆性、黏性、咀嚼性、回復性、彈性、內聚性、膠黏性8個指標，綜合分析，選取硬度、彈性、咀嚼性、內聚性和回復性5個指標進行分析。

質構儀TPA模式為：探頭為P/36R，測試前速度為1 mm/s，測試速度為1 mm/s，測試后速度為1 mm/s，應變量為80%，觸發模式為自動力，觸發力為5 g，2次壓縮間隔時間為5 s。

1.3.7 牛肉脂肪酸測定

脂肪提取：參照FOLCH[17]方法，取肉糜(0.300±0.005)g于具塞錐形瓶中，按1∶20(g∶mL)比例加入60 mL氯仿甲醇溶液(體積比2∶1)，攪拌均勻后靜置浸提5 h，然后于40 ℃水浴中繼續脂肪浸提30 min，然后加入15 mL飽和氯化鈉溶液于具塞錐形瓶中并攪拌溶液，待溶液完成靜置分層后，取下層有機溶劑于容量瓶中40 ℃旋轉蒸干。

脂肪酸甲酯化：參照標準GB/T 17376—2008《動植物油脂 脂肪酸甲酯制備》制備脂肪酸甲酯。取6 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液于容量瓶中，冷凝回流皂化30 min，然后從冷凝管管口加入5 mL 25%三氟化硼甲醇溶液于容量瓶中進行甲酯化，15 min后再次從冷凝管管口加入2 mL 25%三氟化硼甲醇溶液于容量瓶中，15 min后從冷凝管管口加入4 mL 正己烷于容量瓶中，立即取下容量瓶，加入20 mL飽和食鹽水后猛烈搖晃容量瓶15 s，繼續加入飽和食鹽水至容量瓶瓶口，待溶液靜置分層后，取上層有機溶液于血清瓶中，充氮氣后密封保存在-18 ℃冰箱中備檢測。參照楊藝婷方法[18]制定37種脂肪酸甲酯混標標準曲線，以外標法對脂肪酸進行定量，以37種脂肪酸甲酯的保留時間和譜庫檢索及人工手動檢索進行定性。

GC-MS條件：GC色譜柱Rtx-5MS-1(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。柱溫升溫程序，從120 ℃開始，先以7 ℃/min升至250 ℃，再以8 ℃/min升至310 ℃，保持5 min，汽化室溫度260 ℃，進樣量1 μL，柱前壓120 KPa，載氣：高純度氦氣(99.999%)，柱內載氣流量1.48 mL/min，進樣方式：不分流。MS離子源為電子轟擊源，離子源溫度200 ℃，接口溫度300 ℃，電子能量70 eV，倍增器電壓0.2 kV，溶劑延遲3.5 min，質量掃描范圍50～600 Hz。

1.3.8 牛肉蛋白質測定

稱取烘干研磨成粉末的牛肉(0.300 ± 0.005)g、0.717 g CuSO4·5H2O、6.282 g K2SO4和10 mL濃硫酸于消化管中，將消化管置于消化爐上于420 ℃消化1 h，待消化管冷卻至室溫后在全自動凱氏定氮儀上進行蛋白質含量(%)測定。

1.3.9 牛肉色度指標測定

將牛肉糜置于測色儀上進行色度指標測量，色度指標通過L*(亮度)、a*(紅度)、b*(黃度)3個值表示。

1.3.10 驗證組牛肉指標測定

將凍藏時間為5、8、12個月的牛肉與試驗組進行相同指標測定，方法同上。

1.4 統計分析

試驗所得數據均采用SPSS(21.0)進行顯著性方差分析(Duncan)和主成分分析，數據以平均數±標準差表示。運用Excel進行趨勢線擬合。

2 結果與分析

2.1 不同凍藏時間牛肉的TVB-N含量

不同凍藏時間牛肉TVB-N的含量如圖1所示。隨凍藏時間的延長，牛肉TVB-N含量呈現增長的變化趨勢 (p<0.01)，TVB-N含量與凍藏時間擬合的多項式方程為y=-0.78x2+10.78x-4.68 (R2=0.98)。凍藏3個月牛肉的TVB-N含量已超過一級鮮肉標準 (≤15 mg/100g)，凍藏18個月牛肉的TVB-N含量超過二級鮮肉標準 (15～25 mg/100g)。TVB-N含量是肉中反應蛋白質氧化程度的指標，凍藏3個月牛肉較凍藏0個月牛肉的TVB-N含量相比增長了2.87倍，凍藏42個月牛肉較凍藏18個月牛肉的TVB-N含量相比增長了0.19倍，凍藏66個月牛肉較凍藏42個月牛肉的TVB-N含量相比增長了0.07倍，結果表明隨凍藏時間的延長牛肉TVB-N含量變化顯著，并且凍藏時間越長牛肉TVB-N含量增長速率減慢。

圖1 不同凍藏時間牛肉的TVB-N含量Fig 1 TVB-N content of beef at different frozen storage time注：同一曲線上不同小寫字母表示牛肉TVB-N含量變化顯著(p<0.05)。下圖同。

2.2 不同凍藏時間的牛肉水分含量

不同凍藏時間牛肉的水分含量如圖2所示。隨凍藏時間的延長，牛肉水分含量極顯著降低 (p<0.01)，水分含量與凍藏時間擬合的多項式方程為y=-0.29x2-1.05x+78.60 (R2=0.97)。凍藏3個月、7個月牛肉的水分含量低于凍藏0個月牛肉的水分含量但差異不顯著 (p>0.05)，說明較短凍藏時間對牛肉水分含量影響不顯著；凍藏18、42和66個月牛肉的水分含量均極顯著小于凍藏0個月牛肉的水分含量 (p<0.01)，且分別較凍藏0個月牛肉的水分含量下降了11%、15%和20%，說明凍藏時間越長對牛肉水分含量的影響越大。

圖2 不同凍藏時間牛肉的水分含量Fig.2 Water content of beef at different frozen storage time

2.3 不同凍藏時間牛肉的系水力

不同凍藏時間牛肉的系水力如圖3所示。

圖3 不同凍藏時間牛肉的系水力Fig.3 Water holding capacity of beef at different frozen storage time

牛肉系水力隨凍藏時間的延長呈極顯著變化 (p<0.01)，可見凍藏時間對牛肉的組織結構完整和蛋白質結合水能力產生了明顯影響。新鮮肉的系水力顯著高于凍藏條件下系水力值，凍藏3、7和18個月牛肉的系水力呈減少趨勢但無顯著差異 (p>0.05)，說明凍藏18個月內凍藏時間對牛肉系水力的影響較小；凍藏42個月和66個月牛肉的系水力升高，說明超長凍藏時間對牛肉系水力有顯著影響。

2.4 不同凍藏時間牛肉的pH值

不同凍藏時間牛肉的pH值如圖4所示。牛肉pH值在凍藏66個月內變化極顯著 (p<0.01)。隨凍藏時間的延長，牛肉pH值呈先上升后下降的變化趨勢，在凍藏3個月時牛肉pH值呈最高值(6.63)，凍藏時間超過7個月后，牛肉pH值呈下降的趨勢，且牛肉pH值表現為酸性。

圖4 不同凍藏時間牛肉的pH值 Fig.4 The pH value of beef at different frozen storage time

2.5 不同凍藏時間牛肉的物性指標

不同凍藏時間牛肉的物性指標如表1所示。隨著凍藏時間的延長，牛肉的硬度、彈性、內聚性、咀嚼性和回復性5個指標均呈先下降后上升極顯著趨勢 (p<0.01)，5個物性指標均在凍藏7個月內呈下降趨勢，凍藏3個月、7個月牛肉較凍藏0個月牛肉相比硬度分別降低了29%和36%，彈性分別降低了49%和62%，咀嚼性分別降低了61%和81%；凍藏7個月到66個月內5個物性指標均呈上升趨勢。可見，凍藏時間對牛肉的物性指標有顯著的影響。

注：同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。下表同。

2.6 不同凍藏時間牛肉的脂肪酸

不同凍藏時間牛肉的脂肪酸種類和含量如表2所示。隨凍藏時間的延長，牛肉總脂肪酸含量(total FA)、飽和脂肪酸含量(SFA)極顯著下降 (p<0.01)，單不飽和脂肪酸(MUFA)含量和多不飽和脂肪酸(PUFA)含量雖略有波動但總體也呈極顯著下降趨勢 (p<0.01)。凍藏3、7、18、42和66個月牛肉的total FA含量分別較凍藏0個月牛肉的含量下降了15%、24%、29%、38%和42%，說明凍藏時間對牛肉total FA含量有顯著影響，且凍藏時間越長對牛肉total FA含量的影響越大。凍藏3、7個月牛肉均未檢測出二十碳四烯酸 (C20:4 cis5,8,11,14)，凍藏3個月、7個月和18個月的牛肉均未檢測出二十碳三烯酸 (C20:3 cis8,11,14)。本試驗檢測出的反式脂肪酸只有反式油酸 (C18:1 trans-9)，隨凍藏時間的延長，牛肉C18:1 trans-9占Total FA含量的百分比極顯著升高 (p<0.01)。可見，凍藏時間對牛肉脂肪酸含量有顯著影響。

2.7 不同凍藏時間牛肉的蛋白質含量

不同凍藏時間牛肉的蛋白質含量如圖5所示。隨凍藏時間的延長，牛肉蛋白質含量極顯著降低(p<0.01)，蛋白質含量與凍藏時間擬合的多項式方程為y=-0.05x2-1.15x+93.22 (R2=0.97)。凍藏3、7、18、42、66個月較凍藏0個月牛肉的蛋白質含量相比分別下降了1.4%、0.8%、4.76%、5.7%、8.43%。可見，凍藏時間對牛肉蛋白質含量有顯著影響。

圖5 不同凍藏時間牛肉的蛋白質含量Fig.5 Protein content of beef at different frozen storage time

2.8 不同凍藏時間牛肉的色度指標

不同凍藏時間牛肉的色度指標L*、a*、b*值如表3所示。隨凍藏時間的延長，牛肉色度L*、a*、b*值均呈先下降后上升極顯著變化趨勢 (p<0.01)。在凍藏0～18個月內，牛肉色度L*、a*、b*值均極顯著降低 (p<0.01)，凍藏3、7、18個月較凍藏0個月相比L*值分別下降了33%、36%、42%，a*值分別下降了11%、18%、24%，b*值分別下降了19%、23%、24%。凍藏66個月牛肉色度L*、a*、b*值均小于凍藏42個月牛肉的色度L*、a*、b*值。可見，凍藏時間對牛肉色差值有顯著影響。

表3 不同凍藏時間牛肉的色度指標Table 3 Color indexes of beef at different frozenstorage time

2.9 主成分分析

2.9.1 主成分分析結果

綜合分析，選取L*(X1)、a*(X2)、b*(X3)、TVB-N(X4)、蛋白質含量(X5)、pH值(X6)、系水力(X7)、水分含量(X8)、硬度(X9)、彈性(X10)、內聚性(X11)、咀嚼性(X12)、回復性(X13)、total FA(X14)、SFA(X15)、MUFA(X16)、PUFA(X17)、反式脂肪酸占總脂肪酸的百分比(X18)18個指標進行主成分分析，探求不同凍藏時間下牛肉指標的變化情況，用較少的指標代替較多的指標且保留原指標的主要信息，以期建立牛肉理化、物性等指標與凍藏時間的模型來預測牛肉凍藏時間。

由表4可知，18個指標之間有些相關系數較大即相關性較高，有些相關系數較小即相關性較低，所以用主成分方法提取主要成分來分析牛肉凍藏時間是合適的。由表5可知，前3個主成分的累計方差貢獻率達91.82%，故選取3個主成分來綜合分析牛肉凍藏時間。根據表6的主成分特征向量構建主成分與凍藏牛肉的18個指標的線性關系式如下：

Y1=0.250×X1+0.275×X2+0.203×X3-0.294×X4+0.239×X5+0.080×X6+0.231×X7+0.228×X8+0.299×X9+0.250×X10+0.129×X11+0.274×X12+0.101×X13+0.294×X14+0.275×X15+0.294×X16+0.125×X17-0.217×X18

(3)

Y2=0.203×X1+0.085×X2+0.236×X3+0.161×X4-0.218×X5-0.425×X6+0.278×X7-0.284×X8+0.131×X9+0.235×X10+0.206×X11+0.192×X12+0.302×X13-

0.175×X14-0.228×X15-0.111×X16+0.190×X17+0.334×X18

(4)

Y3=0.284×X1+0.229×X2+0.336×X3+0.048×X4-0.013×X5+0.084×X6+0.101×X7+0.052×X8-0.065×X9-0.179×X10-0.416×X11- 0.164×X12-0.409×X13-0.068×X14-0.076×X15-0.192×X16-0.509×X17-0.024×X18

(5)

將18個指標標準化后，以3個主成分Y1、Y2、Y3各自的特征值占總特征值的比率為權重構建凍藏牛肉時間的綜合評價模型Y，Y是Y1、Y2、Y3的線性組合，即：Y=0.590×Y1+0.280×Y2+0.130×Y3，綜合分析結果如表7所示。在凍藏0～18個月內，隨凍藏時間的延長，綜合得分越小，在凍藏42～66個月內綜合得分呈降低趨勢，但較凍藏7個月和18個月綜合得分高。綜合分析本試驗得出的牛肉凍藏時間的模型不適于超長凍藏時間的牛肉，但可以較好預測18個月以內的凍藏牛肉。

2.9.2 綜合評價模型的檢驗

為了驗證18個肉品質指標與凍藏時間之間所建立模型的效果，對凍藏0、3、7個月的牛肉繼續凍藏5個月，得到凍藏5、8、12個月的牛肉樣品，然后進行18個相同肉品質指標的測定，所測指標與相應凍藏時間進行綜合評價，得到表8。綜合表7和表8結果可知，隨著凍藏時間的延長，綜合評價結果越低，可見本研究所建立的評價模型比較合理，可以用于凍藏18個月以內牛肉凍藏時間的預測。

表4 指標間相關矩陣表Table 4 Correlation Matrix of indexes

表5 解釋總方差Table 5 Total Variance Explained

注：提取方法：主成分分析。

表6 各主成分的特征向量Table 6 Eigenvector of each principal component

表7 不同凍藏時間牛肉的指標綜合評價結果Table 7 Comprehensive evaluation result of indexes of beefat different frozen storage time

表8 凍藏5、8和12個月牛肉的指標綜合評價結果Table 8 Comprehensive evaluation result of indexes of beefat frozen 5, 8 and 12 months

3 討論

3.1 凍藏時間對牛肉新鮮度的影響

國家標準GB/T 17238—2008《鮮、凍分割牛肉》規定-18 ℃凍藏牛肉時間不能超過12個月。TVB-N含量、pH值被眾多研究者作為判斷肉品新鮮程度的重要指標，本試驗發現凍藏18個月的牛肉TVB-N含量剛超過二級鮮肉標準，pH值呈下降趨勢，與張亞芬等[19]、高世昌等[20]的腐肉pH值超過6.7結論不一致，所以僅通過TVB-N含量和pH值兩項指標無法判定超長凍藏牛肉新鮮程度。潘曉倩等[21]研究當TVB-N值超過新鮮肉最高限值，菌落總數也已接近國家標準。龔慶華等[22]研究凍藏15個月的豬肉品質時，也發現TVB-N含量仍在二級新鮮標準，但脂質氧化指標顯示豬肉脂質氧化程度嚴重。所以在判定超長凍藏時間牛肉新鮮度時，需對TVB-N含量、pH值及蛋白質和脂肪氧化產物等指標綜合分析。

3.2 凍藏時間對牛肉質構特性的影響

質構特性是研究牛肉品質的重要指標。隨著凍藏時間的延長，牛肉肌細胞間形成大小不一的冰晶不斷生長，肌細胞內的水分透過細胞膜使肌細胞間的冰晶逐漸長大，擠壓肌細胞對細胞造成機械性損傷，使其組織結構完整性被破壞，導致質構特性發生變化。SUBBAIAH等[23]研究-18 ℃下凍藏150 d魚的結構變化及蛋白質降解，發現低溫貯藏魚肉質地變化是由于蛋白質的變性和水解。ESTRADA-SOLS等[24]從電鏡中觀察發現凍藏時間影響肉的超微結構。黃鴻兵[25]從電鏡中觀察到，凍藏在-15 ℃或更低溫度下的豬肉，其肌纖維間的空隙由于冰晶擠壓而完全消失，肌纖維與肌內膜分離明顯，余小領等[26]對凍藏不同時間豬肉的微結構發現，凍藏7個月的樣品的冰晶尺寸顯著增大，冰晶生長使肌束受壓而擠在一起，戚軍[27]研究凍融次數對羊肉品質影響時發現，隨凍融次數增加，肌節框架結構逐漸消失、肌內膜破裂、肌纖維直徑逐漸下降。這與本試驗對不同凍藏時間牛肉的物性指標變化檢測結果相一致，凍藏0～18個月牛肉的硬度、彈性等指標隨凍藏時間的延長極顯著降低。

3.3 凍藏時間對牛肉保水性的影響

保水性是評價凍藏肉品質的重要指標之一，肌肉保水性下降，會影響其肉制品的多汁性，同樣會降低消費者的可接受程度[28]。保水性是指肉保持水分的能力，通常以汁液損失率、滴水損失率和加壓系水力來評價凍藏肉的保水能力，汁液損失還含有大量的可溶性蛋白質[18]，多項研究[19, 29-32]標明蛋白質的結構與存在狀態與肌肉的保水性有較高的相關性。李儒仁等[33]研究耗牛肉在凍藏期間蛋白質、脂質氧化對保水性的影響，結果發現凍藏條件下蛋白質羰基化反應影響了保水性。這與本試驗研究結果相一致，隨凍藏時間延長，牛肉蛋白質含量和水分含量均極顯著減少，系水力總體呈降低趨勢，凍藏42個月和66個月牛肉的系水力有所升高，可能是由于樣品中的肌束由于冰晶擠壓聚集緊密，加之其含水量較低，所以表現為系水力有所升高，這也解釋了凍藏42個月和66個月硬度、彈性等指標有所上升的原因。

3.4 凍藏時間對牛肉脂肪酸的影響

凍藏過程中牛肉脂質依然在發生水解、氧化等反應，可見凍藏只能延緩而不能阻止肉中脂肪酸敗，金屬離子和活性氧自由基都能促進脂肪的氧化。有多項研究表明，隨凍藏時間的延長，牛肉TBARS值逐漸上升，SOYER等[34]研究表明凍藏過程中均發生蛋白質氧化和脂質氧化，且二者有相互促進的作用，可能是由于脂肪氧化會導致局部氧分壓過高，進而引發或加速氧合肌紅蛋白的氧化[35]。這也解釋了本試驗對凍藏時間的延長，牛肉total FA、SFA、MUFA及PUFA極顯著降低的原因，凍藏過程中的脂質和脂肪酸氧化及解凍過程中微生物和內源酶對脂肪酸的共同作用均使得脂肪酸含量降低。凍藏42個月和66個月的牛肉能聞到明顯的酸敗味道，可能是脂肪氧化產生的醛類、酮類等物質和哈敗的味道。反芻動物體內的異構化酶導致了不飽和脂肪酸的順反異構化，進而傳遞到自身脂肪中[36-38]，使得反芻動物脂肪中含有一定量的脂肪酸。本試驗發現隨凍藏時間的延長牛肉的反式脂肪酸占總脂肪酸的百分比極顯著上升，可能是由于凍藏和解凍過程中，在自身生化因子和微生物作用下，加速了不飽和脂肪酸的異構化和飽和脂肪酸的氧化，使得反式脂肪酸占總脂肪酸的百分比極顯著上升。

3.5 凍藏時間對牛肉顏色的影響

牛肉的顏色受多個因子的影響[39]，CIARAMELLA等[40]分析在低溫貯藏過程中，肌肉蛋白質降解及色素與肌肉蛋白的結合導致魚肉色澤發生變化。MONTGOMERY等[41]指出紅肉中肉色的褪色或氧化酸敗主要是由肌紅蛋白的氧化和脂肪的氧化引起，肌紅蛋白中亞鐵血紅素基團中心的鐵原子的氧化對肉褪色起到主要作用，氧化使紅色的氧合肌紅蛋白轉化成棕褐色的高鐵肌紅蛋白，脂肪的氧化促進了a*值的降低，這與本研究的結果一致，凍藏過程中，牛肉水分升華，肌紅蛋白肽鏈伸展增大了與氧氣的接觸面積而逐漸氧化成高鐵肌紅蛋白，低溫抑制了高鐵肌紅蛋白還原酶的活性，使高鐵肌紅蛋白得到積累，牛肉解凍過程中在微生物和內源酶的作用下肌紅蛋白氧化成高鐵肌紅蛋白，所以a*值隨凍藏時間延長而降低。AKAMITTATH[42]研究表示，脂類氧化會引起肉表面b*值升高，這與本研究的結果不一致，肌細胞間的冰晶逐漸生長使牛肉解凍后完整性被破壞，解凍后易于被微生物侵染，可能由于解凍過程中牛肉在微生物作用下生成綠色的硫化物不斷積累，使牛肉糜b*值不斷降低。凍藏42個月和66個月牛肉均較凍藏3～7個月內的牛肉糜的色度L*、a*、b*值升高，可能是由于隨凍藏時間延長牛肉水分升華，干耗現象明顯，凍藏42個月和66個月牛肉表面形成層較厚的干膜層，延緩了內層肉的水分升華和肌紅蛋白的氧化，也減少了微生物對內層肉中蛋白質等物質的氧化分解，使得凍藏42個月和66個月牛肉測得的色度L*、a*、b*值增大。

3.6 評價主成分分析方法建立預測牛肉凍藏時間模型

主成分分析方法是考察多個定量變量間相關性的一種多元統計方法，導出幾個主成分使得它們盡可能保留原始變量的信息，且彼此不相關。主成分分析常被用來尋找判斷某種事物或現象的綜合指標，并結合綜合指標所蘊藏的信息以恰當的解釋，以便更深刻地揭示事物內在的規律[43-45]。李夢琴等[46]應用主成分方法分析不同品種的小麥加工制成的面條品質指標，優選出制作面條的幾個品種。本試驗篩選出18個凍藏牛肉的指標采用主成分分析方法建立預測凍藏牛肉的綜合分析模型，從綜合評價結果顯示，在牛肉凍藏0～18個月內，隨凍藏時間的延長，綜合評價結果越低，預測效果較好，在牛肉凍藏42個月和66個月的綜合評價結果較高于凍藏7個月和18個月，預測效果不理想。可能是凍藏時間較長，牛肉表面的干膜層對內層肉指標的檢測結果有影響，所以預測結果較差。在以后的研究中，增加檢測蛋白質和脂質氧化產物的指標可能會提高模型的預測效果。

4 結論

隨牛肉凍藏時間的延長，牛肉營養品質和質構特性變化明顯，其中，TVB-N含量極顯著升高，水分含量極顯著降低，系水力呈先下降后上升的極顯著變化趨勢，蛋白質含量極顯著降低，pH值呈先升高后降低的極顯著變化趨勢；牛肉的硬度、彈性、內聚性、咀嚼性和回復性均呈先下降后上升的極顯著變化趨勢；牛肉total FA、SFA、MUFA及PUFA含量均總體呈極顯著減少趨勢，反式脂肪酸占總脂肪酸的百分比極顯著上升；牛肉色度指標L*值、a*值、b*值均呈下降后上升極顯著變化趨勢。運用主成分分析方法將18個指標與凍藏時間建立的模型得出的綜合評價結果能很好的預測牛肉18個月的凍藏期限。因此，本研究結果為科研工作者和生產人員在鑒別凍藏牛肉時間方面提供一定的理論基礎及依據，為鑒別不同凍藏時間原料肉的混合肉提供一定的理論基礎。