基于免疫磁珠的膠體金免疫層析法同時(shí)檢測(cè)豬肉中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸和喹噁啉-2-羧酸

周松，劉河冰，馬立才，丁亞芳，張佳林，白春陽(yáng)，陶曉奇*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(北京維德維康生物技術(shù)有限公司，北京，100095)

喹乙醇和卡巴氧是化學(xué)合成的廣譜類(lèi)抗菌類(lèi)藥物，都屬于喹噁琳類(lèi)藥物(圖1)。該類(lèi)藥物具有顯著的促進(jìn)生長(zhǎng)和治療、預(yù)防動(dòng)物疾病等作用，常用作飼料添加劑[1-3]。喹乙醇和卡巴氧在動(dòng)物體內(nèi)可分別快速代謝成3-甲基-喹噁啉-2-羧酸(3-methyl-quinoxaline-2-carboxylic acid, MQCA)和喹噁啉-2-羧酸(quinoxaline-2-carboxylic acid, QCA)[4]，MQCA和QCA是喹乙醇和卡巴氧殘留檢測(cè)的標(biāo)志物。研究報(bào)道顯示，MQCA和QCA對(duì)人體具有致癌，致突變和致畸等潛在危害，尤其對(duì)人體長(zhǎng)壽細(xì)胞具有較大的危害作用[5]。因此，喹乙醇已經(jīng)被美國(guó)和歐美禁用[6]。同時(shí)，在1998年歐盟禁止卡巴氧在動(dòng)物飼料中添加。在中國(guó)，喹乙醇藥物在動(dòng)物使用中規(guī)定了最高殘留限量，喹乙醇藥物僅允許在體重少于35 kg的豬的飼料中使用。對(duì)于豬組織和豬肝中的MQCA的最大殘留限量分別為4和50 μg/kg。2003年，糧農(nóng)和世界衛(wèi)生組織專(zhuān)家委員會(huì)要求相關(guān)部門(mén)需要規(guī)定出食品MQCA藥物的最高殘留限量和喹乙醇藥物每天最大攝入量[7]。因此，需要靈敏、快速和高通量的檢測(cè)技術(shù)。

圖1 喹噁琳類(lèi)藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of quinoxaline antibiotics

到目前為止，已經(jīng)有較多的方法檢測(cè)在動(dòng)物組織中MQCA和QCA的殘留，包括液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[7-9]，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[10]，高效液相色譜[11-12]。儀器檢測(cè)方法是公認(rèn)的最可靠的檢測(cè)方法，但是繁瑣的樣本前處理，昂貴的設(shè)備，專(zhuān)業(yè)的操作知識(shí)限制了該方法的廣泛應(yīng)用，檢測(cè)規(guī)模也不適用于高通量的快速檢測(cè)要求。

基于抗原抗體特異性結(jié)合的免疫檢測(cè)方法越來(lái)越多，針對(duì)喹乙醇，卡巴氧及其代謝物免疫檢測(cè)方法主要包括時(shí)間分辨熒光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay，TR-FIA)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和膠體金免疫層析方法(colloidal gold immunochromatographic assay，CGICA)等[1, 3, 13-15]。在這些方法中，TR-FIA方法，靈敏性較高，需要特殊讀數(shù)儀器，不適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，限制該方法的使用。ELISA方法，可以較準(zhǔn)確定量檢測(cè)，但是包括復(fù)雜的試驗(yàn)步驟，主要包括孵育、洗滌、反應(yīng)等，都需要較長(zhǎng)的時(shí)間，對(duì)基質(zhì)干擾和反應(yīng)條件比較敏感，同時(shí)需要特殊設(shè)備(酶標(biāo)讀數(shù)儀)，這類(lèi)檢測(cè)方法不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和快速定性檢測(cè)。CGICA主要受限于靈敏度低，不能滿(mǎn)足低檢測(cè)限檢測(cè)要求[16]。除此之外，組織中MQCA和QCA的檢測(cè)，樣本前處理方法大多是氮吹法[1, 17-19]，有機(jī)試劑的使用，不利于環(huán)境友好型要求，同時(shí)需要特殊設(shè)備(氮吹儀)等，限制了這類(lèi)方法的廣泛應(yīng)用，尤其是現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方面。在不斷探索樣本前處理方面，免疫磁珠的出現(xiàn)提供了新的途徑，該方法可實(shí)現(xiàn)高特異性目標(biāo)藥物的提取、快速分離、高倍數(shù)富集，結(jié)合簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法(如CGICA)，可同時(shí)解決靈敏度低和檢測(cè)程序繁瑣等問(wèn)題。

本文建立一種基于免疫磁珠提取、凈化和富集豬肉中MQCA和QCA靈敏的快速膠體金免疫層析定性和定量檢測(cè)方法(圖2)。免疫磁珠分離技術(shù)將分離與富集結(jié)為一體，具有高效、快速和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)免疫磁珠富集凈化結(jié)合膠體金免疫層析法同時(shí)檢測(cè)豬肉中MQCA和QCA的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬建立以免疫磁珠富集凈化結(jié)合膠體金免疫層析法同時(shí)檢測(cè)豬肉中的MQCA和QCA殘留的方法，以期為豬肉中MQCA和QCA的檢測(cè)提供一種新的有效的檢測(cè)手段。

圖2 基于免疫磁珠處理的膠體金免疫層析檢測(cè)豬肉中MQCA和QCA流程圖Fig.2 The scheme of CGICA with immunomagnetic beads for the determination of MQCA and QCA in pork

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MQCA、QCA標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)，卵血清蛋白(ovalbumin, OVA)，N-二甲基甲酰胺(N-dimethylformamide, DMF)，乙基二甲氨基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC HCl)，生物素化酯(biotinamidohexanoic acid 3-sulfo-N-hydroxysuccinimide ester, BAC-SufoNHS)，N-羥基琥拍酰亞胺(NHS)等購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；羊抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Jackson ImmunoResearch公司；KH2PO4，NaH2PO4，NaCl，NaBH4購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；鏈霉親和素磁珠購(gòu)自于賽默飛世爾科技公司(挪威)；磷酸緩沖液(Phosphate buffer, PB.包括NaH2PO4和Na2HPO4)；磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate-buffered saline, PBS.包括Na2HPO4, KH2PO4, NaCl和KCl)。

1.2 設(shè)備耗材

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS/MS)，Waters公司；硝酸纖維素膜(nitrocellulose membrane, NC膜)，Millipore公司；卡殼，上海金標(biāo)生物科技有限公司；PVC背板，上海良信科技有限公司；劃膜儀，美國(guó)BioDot公司；噴金儀，日本Hitachi公司；切條機(jī)，上海金標(biāo)生物科技有限公司；膠體金免疫層析定量分析儀，北京維德維康生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫原和包被原的制備

半抗原合成方法根據(jù)報(bào)道[14, 20]改進(jìn)得到。戊二醛法合成免疫原和包被原。0.1 mmol MQCA-NH2溶于1 mL DMF溶劑中。BSA或OVA溶于5 mL PBS(0.01 mol/L， pH為7.4)，然后逐滴加入到MQCA-NH2溶液中，伴隨攪拌。2 h后逐滴加入甲醛(0.05 mmol)，攪拌過(guò)夜。將NaBH4(0.3 mmol)溶于5 mL PBS溶液中，混勻后逐滴加入到過(guò)夜后的反應(yīng)體系中。室溫下攪拌2 h。0.01 moL/L PBS透析8次，于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 單克隆抗體制備

單克隆抗體用BALB/c小鼠制備。第1次免疫劑量為100 μg/小鼠，將MQCA-NH2-BSA與弗氏完全佐劑和不完全佐劑乳化后注入小鼠體內(nèi)，兩周后加強(qiáng)免疫，免疫的劑量與第1次使用量相同。經(jīng)過(guò)6次免疫后，選出抗體效價(jià)最高的小鼠，取出脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間培養(yǎng)，通過(guò)直接ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液，篩選出能生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)性能抗體的雜交瘤細(xì)胞，優(yōu)質(zhì)性能主要包括抗體效價(jià)高和特異性高。將篩選的雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔，經(jīng)過(guò)2周培養(yǎng)，從小鼠腹腔取出腹水，經(jīng)過(guò)免疫親和柱的純化，純化后的抗體放在-20 ℃下備用。

1.3.3 膠體金免疫層析檢測(cè)卡的制備

膠體金免疫層析檢測(cè)卡的制備包括膠體金制備，膠體金與抗體偶聯(lián)(膠體金探針)，NC膜上T線(xiàn)和C線(xiàn)的包被及檢測(cè)卡整體組裝，組裝后如圖2中檢測(cè)卡所示。膠體金的制備，本文制備直徑為40 nm膠體金顆粒。36 mL 20 g/L的HAuCl43H2O加入到900 mL蒸餾水中加熱至充分沸騰。在攪拌下加入79.5 mL(1%)檸檬酸三鈉溶液，當(dāng)溶液顏色由香蕉黃變成酒紅色，繼續(xù)保持溶液沸騰狀態(tài)10 min，冷卻至室溫，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)觀(guān)察膠體金顆粒的分散均勻程度和計(jì)算金顆粒直徑大小[3]。膠體金探針的制備，取1g膠體金溶液于1.5 mL離心管中，分別加入10、15、20、25、30、35、40 μL 0.1 moL/L K2CO3調(diào)節(jié)溶液pH，室溫下于3D旋轉(zhuǎn)儀混合反應(yīng)10 min。分別加入0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5和6 μg的MQCA單克隆抗體，快速混勻，室溫下于3D旋轉(zhuǎn)儀混合反應(yīng)10 min，加入20 μL 20% BSA溶液進(jìn)行封閉，室溫下于3D旋轉(zhuǎn)儀混合反應(yīng)10 min，12 000 r/min 離心30 min，移去上清液，用移液器將上清液吸取干凈，加入200 μL復(fù)溶液，超聲混勻1 min，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩⒛z體金探針用噴金儀噴在金標(biāo)墊上，37 ℃過(guò)夜烘干，根據(jù)調(diào)試的優(yōu)化條件等比例放大標(biāo)記。

樣本墊處理方法[21]，將玻纖膜用0.1 moL/L PBS(包含有1%BSA，0.5%Tween-20，0.05%疊氮化鈉，pH=7.4)浸泡，然后在60 ℃下烘干2 h。結(jié)合墊用6%蔗糖溶液浸泡，然后于60 ℃下烘干2 h。將膠體金探針用噴金儀均勻噴在結(jié)合墊上(1.2 μL/cm)，37 ℃下烘干過(guò)夜。MQCA-NH2-BSA(14.4 mg/mL)，羊抗鼠二抗(12 mg/mL)通過(guò)劃膜儀包被在NC膜上分別作為T(mén)線(xiàn)和C線(xiàn)，T線(xiàn)和C線(xiàn)的稀釋倍數(shù)分別為2、4、8、12、16、20、24、28倍，劃膜液包被量分別為0.6、0.7、0.8、0.9 μL/cm，最終搭配膠體金探針通過(guò)棋盤(pán)法篩選出最佳的T線(xiàn)和C線(xiàn)包被濃度，主要依據(jù)T線(xiàn)和C線(xiàn)的良好的形態(tài)(線(xiàn)不能太細(xì)或者太寬，是很均一的線(xiàn)條)和良好的藥物抑制效果(靈敏度較高)。PVC底板，樣品墊樣品墊樣品墊，結(jié)合墊，NC膜和吸收墊的組裝如圖2所示。

1.4 樣本前處理

本實(shí)驗(yàn)采用免疫磁珠提取、分離和富集樣本中MQCA和QCA藥物。主要包括抗體生物素化，免疫磁珠的構(gòu)建，MQCA和QCA的提取，分離，洗脫富集。

1.4.1 抗體生物素化

將純化后的MQCA單克隆抗體(19.84 mg/mL)用0.05 mol/L PBS調(diào)整濃度至2～3 mg/mL，加入相應(yīng)量的生物素化酯(BAC-SufoNHS)，抗體和生物素化酯的摩爾比例為1/5，25 ℃下旋轉(zhuǎn)混合反應(yīng)2 h，用0.01 mol/L PBS透析8次，獲得生物素化的抗體。

1.4.2 免疫磁珠的制備

移液槍吸取鏈霉親和素磁珠1 mg(100 μL 10 mg/mL磁珠混合液)，加入到2 mL離心管中，將離心管放入磁力架磁吸30 s，移除液體，將離心管從磁力架中取下，放入離心管架，加入1 mL緩沖液(0.01 mol/L PBS，pH 7.4)，加入一定量生物素化抗體，輕輕混勻。室溫下，放入搖床上慢慢搖晃30 min，讓生物素化后的抗體與親和素修飾的磁珠通過(guò)生物親和素作用偶聯(lián)在一起，從而構(gòu)建成免疫磁珠。反應(yīng)30 min后，將帶有混合磁珠液的離心管放入磁力架磁吸30 s，移液槍移除液體，取下離心管放入離心管架，加入1 mL封閉緩沖液(0.01 mol/L PBS中含有0.01% BSA)，輕輕混合10 S，放入磁架磁吸30 s，移除液體，依次重復(fù)4次，然后加入1 mL 0.01mol/L PBS重懸備用(1mg/mL)，4 ℃下保存。

1.4.3 免疫磁珠處理實(shí)際樣本

從本地(重慶超市)購(gòu)買(mǎi)豬肉樣本，經(jīng)過(guò)液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)方法[22]挑選出不含MQCA和QCA的陰性樣本，作為空白基質(zhì)。

1.4.3.1 定性檢測(cè)

稱(chēng)5 g勻漿，分別添加一定量MQCA和QCA標(biāo)準(zhǔn)品，使樣本中分別含有0、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、4 μg/kg MQCA藥物和0、0.13、0.25、0.63、1.25、2.5、5和10 μg/kg QCA藥物。加入10 mL 0.01 mol/L PBS，渦動(dòng)3 min。4 000 r/min離心5 min，取一定量上清液于新離心管中，分別加入一定量(50、100、150、200、250 μL)的免疫磁珠液，室溫下反應(yīng)8 min。將離心管放入磁力架，磁吸30 s，移去上清液，將離心管從磁力架取下，加入0.01 mol/L PBS到離心管中，混合10 s，離心管放入磁力架，磁吸30 s，如此循環(huán)3次。將洗滌后的帶有磁珠的離心管取下，加入0.02 mol/L PB液復(fù)溶，放入金屬浴中加熱，將吸附在磁珠上的MQCA和QCA藥物洗脫到復(fù)溶液中，復(fù)溶液作為模擬樣本液并用ELISA試劑盒計(jì)算MQCA(QCA)的回收率。檢測(cè)液滴加到檢測(cè)卡上層析5 min，用肉眼觀(guān)察T線(xiàn)和C線(xiàn)的相對(duì)深淺判斷樣本中MQCA(QCA)的含量，C和T線(xiàn)顏色一樣深或者T線(xiàn)比C線(xiàn)深時(shí)陰性，C線(xiàn)顏色深，T線(xiàn)顏色比C線(xiàn)顏色淺，或者T線(xiàn)無(wú)色時(shí)是陽(yáng)性，C線(xiàn)不顯色表示無(wú)效。

1.4.3.2 定量檢測(cè)

定量檢測(cè)主要包括標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立和方法檢出限和回收率測(cè)定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立，用免疫磁珠洗脫復(fù)溶液(0.02 mol/L PB)配制MQCA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(0、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、4 μg/kg)，用CGICA檢測(cè)，每個(gè)樣本重復(fù)3次。5 min后用膠體金免疫層析定量分析儀記錄T/C比值。設(shè)定MQCA為0 μg/kg時(shí)，T/C比值為B0，其他濃度時(shí)T/C比值為B。以B/B0為縱坐標(biāo)，添加的MQCA濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制出競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線(xiàn)，計(jì)算檢測(cè)卡半數(shù)抑制濃度和定量范圍。

方法檢出限和回收率測(cè)定，隨機(jī)選取經(jīng)LC-MS/MS檢測(cè)為MQCA陰性的豬肉20份，經(jīng)過(guò)免疫磁珠處理(同定性檢測(cè)免疫磁珠處理方法)后CGICA檢測(cè)，每個(gè)樣品測(cè)試3次，以20個(gè)陰性空白樣品的平均值加上3倍的標(biāo)準(zhǔn)差作為CGICA檢測(cè)限(limit of detection, LOD)。在陰性豬肉中分別添加MQCA和QCA，MQCA的添加濃度 0.1、0.5和2 μg/kg，QCA添加濃度為0.25、1.25和5 μg/kg。根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出檢測(cè)濃度，實(shí)際檢測(cè)濃度與理論濃度的比值百分率即為回收率，重復(fù)檢測(cè) 5次。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原合成

半抗原的設(shè)計(jì)與合成是制備高靈敏性和高效價(jià)抗體的最重要的步驟。本研究最終形成的半抗原MQCA-NH2結(jié)構(gòu)如圖3所示。合成的半抗原通過(guò)LC-MS/MS方法鑒定，結(jié)果顯示半抗原合成成功(圖4)。

圖3 半抗原的合成以及包被原和免疫原合成路線(xiàn)圖Fig.3 Synthesis scheme for the novel haptens and hapten-protein conjugates

圖4 MQCA-NH2半抗原LC-MS/MS鑒定圖Fig.4 The result of synthetic haptens (MQCA-NH2) by LC-MS/MS

MQCA半抗原是小分子物質(zhì)，缺乏免疫原性，需要偶聯(lián)一個(gè)大分子蛋白獲得免疫原性。本文分別將半抗原MQCA-NH2與BSA和OVA偶聯(lián)，形成免疫原和包被原，合成過(guò)程如圖3所示，蛋白分子與MQCA-NH2偶聯(lián)時(shí)，形成一定的特殊結(jié)構(gòu)，蛋白分子和半抗原之間具有一個(gè)連接臂，突出抗原特異性，有利于制備出特異性高的抗體[2, 20]。

2.2 抗體的特性

制備的抗體(19.84 mg/mL)的特性主要包括抗體的效價(jià)和交叉反應(yīng)率。制備出的抗體使用間接ELISA方法[18]驗(yàn)證制備抗體的特性。發(fā)現(xiàn)抗體效價(jià)為1/32 000，抗體的IC50(half maximal inhibitory concentration，IC50)和交叉反應(yīng)率如表1所示。

表1 間接ELISA方法中MQCA抗體的IC50和交叉反應(yīng)率Table 1 The IC50 and cross reactivity of MQCA-mAb inindirect ELISA

其中，制備出的抗體僅與QCA有40%的交叉反應(yīng)率，與其余的具有相似結(jié)構(gòu)的藥物基本無(wú)交叉，證明該抗體特異性較好。

2.3 膠體金的紫外掃描圖譜

通過(guò)肉眼識(shí)別，可以看到膠體金溶液呈現(xiàn)均一的酒紅色。將膠體金溶液在350～600 nm紫外掃描，結(jié)果如圖5所示。

圖5 膠體金紫外光掃描圖譜Fig.5 Determination of colloidal gold by spectrophotometry

通過(guò)圖5可以看出制備的膠體金溶液在539.0 nm左右處具有最大的單一吸收峰。在紫外掃描圖譜中，膠體金顆粒直徑和最大吸收峰之間的關(guān)系Dnm=(λmax-505.53)/0.786[23]，計(jì)算出膠體金顆粒的直徑為42 nm。在波長(zhǎng)為539 nm附近，掃描曲線(xiàn)的峰寬較小，說(shuō)明膠體金顆粒整體上比較均一。采用檸檬酸三鈉還原氯金酸法制備膠體金時(shí)，檸檬酸三鈉加入量會(huì)影響金顆粒的大小和數(shù)目，在氯金酸總量一定情況下，金顆粒數(shù)目越多，生成金顆粒越小。燒制膠體金的時(shí)間和攪拌速度都會(huì)影響膠體金顆粒的形成，反應(yīng)時(shí)間短，氯金酸沒(méi)有被充分還原，生成的膠體金顆粒不均一，但燒制時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則容易發(fā)生聚沉，攪拌太慢反應(yīng)不充分，太快則可能導(dǎo)致溶液飛濺而損失膠體金顆粒。

2.4 膠體金探針制備與T線(xiàn)和C線(xiàn)的劃膜濃度的參數(shù)優(yōu)化

根據(jù)膠體金探針最終形成的顏色，是否聚沉和實(shí)際靈敏性等參數(shù)，1 g膠體金用于調(diào)節(jié)pH的0.1 mol/L K2CO3的加入量為20 μL，偶聯(lián)的抗體量為2.5 μg。抗體與膠體金連接的作用力主要有靜電引力，疏水作用和配位鍵的相互作用。調(diào)節(jié)體系的pH可以將抗體包含在內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴露。當(dāng)pH高于抗體等電點(diǎn)，抗體整體呈負(fù)電性，只是其堿基氨基酸為正電性，在合適的pH條件下，抗體與膠體金連接的主要作用力為疏水作用力。高pH時(shí)，抗體表面帶正電性增加，導(dǎo)致抗體與膠體金之間斥力增強(qiáng)，抗體與膠體金結(jié)合數(shù)目下降，導(dǎo)致膠體金探針與抗原結(jié)合數(shù)目減少，T線(xiàn)顯色變淺。低pH時(shí)，抗體與膠體金顆粒之間的疏水作用力很弱，容易出現(xiàn)膠體金聚沉，形成一定的大顆粒，導(dǎo)致膠體金溶液的顏色變化(由酒紅色變?yōu)楹炙{(lán)色)。根據(jù)不同劃膜液稀釋倍數(shù)與膠體金探針的棋盤(pán)法實(shí)驗(yàn)，得到的優(yōu)化條件為：抗原劃膜(T線(xiàn))濃度為1.2 mg/mL，劃膜噴量為0.7 μL/cm；羊抗鼠二抗(C線(xiàn))劃膜濃度為1.0 mg/mL，劃膜噴量為0.7 μL/cm，在該條件下T線(xiàn)與C線(xiàn)顯色均勻，抑制效果較好。

2.5 磁珠前處理的優(yōu)化

經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，優(yōu)化參數(shù)如下，1 mg鏈霉親和素磁珠需要偶聯(lián)MQCA抗體的量為40 μg；800 μL樣本提取液加入0.1 mg(100 μL)免疫磁珠提取效果最佳；最佳的洗脫溫度和時(shí)間分別為85 ℃和3 min。當(dāng)1 mg鏈霉親和素磁珠偶聯(lián)抗體的量少于40 μg時(shí)，磁珠周?chē)赡苓€有剩余的抗體偶聯(lián)位點(diǎn)，增加抗體用量時(shí)MQCA(QCA)提取的效率提高。當(dāng)加入的抗體量高于40 μg時(shí)，多余的抗體可能會(huì)影響后續(xù)藥物的洗脫效率(影響加熱效率)導(dǎo)致藥物回收率下降。800 μL樣本提取液需要的免疫磁珠用量少于0.1 mg時(shí)，免疫磁珠的吸附的MQCA總量太少，很難達(dá)到檢測(cè)卡的檢測(cè)限要求(靈敏度低)，當(dāng)免疫磁珠加入量高于0.1 mg，造成磁珠浪費(fèi)。洗脫溫度和時(shí)間是影響最終提取MQCA藥物洗脫效率的重要因素。最終結(jié)果表明，85 ℃和3 min是優(yōu)化的洗脫時(shí)間和溫度。洗脫溫度較小時(shí)(<85 ℃)，洗脫效果較差，可能由于低熱量不足以使抗原抗體結(jié)合鍵斷裂，過(guò)度的延長(zhǎng)洗脫時(shí)間則不符合快速檢測(cè)的理念。

免疫磁珠的凈化富集主要包括吸附和洗脫兩個(gè)過(guò)程，吸附是免疫磁珠和樣品中的MQCA或者QCA之間的特異性結(jié)合，從而可以實(shí)現(xiàn)高特異性提取，通過(guò)磁場(chǎng)分離待檢測(cè)藥物與雜質(zhì)，凈化效果顯著，大大簡(jiǎn)化后續(xù)檢測(cè)方法的研究，為檢測(cè)新方法的建立奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)去除基質(zhì)干擾效果較好，可以顯著性提高檢測(cè)方法的靈敏性[24]。根據(jù)豬肉樣本的傳統(tǒng)前處理方法(氮吹法)[1, 13-14]，處理時(shí)間為50 min左右，濃縮倍數(shù)為1～2倍，同時(shí)需要使用有毒有害的一些化學(xué)試劑(乙腈或者乙酸乙酯，正己烷等)，免疫磁珠的處理時(shí)間更短(30min)，濃縮倍數(shù)更高(至少4倍以上)，加熱的洗脫方式，減少有機(jī)試劑的摻入，減少后續(xù)檢測(cè)試驗(yàn)的干擾因素，提高方法的穩(wěn)定性。

2.6 膠體金免疫層析的定性檢測(cè)

不同濃度MQCA(QCA)藥物添加到陰性樣本中，經(jīng)過(guò)免疫磁珠處理后，處理液滴加到制備的膠體金免疫層析檢測(cè)卡上反應(yīng)5 min后，定性檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

表2 膠體金免疫層析法定性檢測(cè)結(jié)果Table 2 Determination result of the colloidal gold immuno-chromatographic assay in qualitatively detection

注：根據(jù)顯色結(jié)果判斷：“++++”：顯色深“+++”：顯色較深“++”顯色明顯“+”：顯色較淺“-”：沒(méi)有顯色，或者肉眼無(wú)法辨別。

陰性樣本，T線(xiàn)顏色微深于C線(xiàn)，當(dāng)加入0.05 μg/kg的MQCA藥物時(shí)，T線(xiàn)顏色和C線(xiàn)基本一樣；當(dāng)加入0.1 μg/kg的MQCA藥物時(shí)，T線(xiàn)顏色明顯比C線(xiàn)淺，定性檢測(cè)卡的LOD為0.1 μg/kg。分別添加0.25、0.5、1、2和4 μg/kg MQCA時(shí)，T線(xiàn)顏色越來(lái)越淺，直至消失。同理可知QCA的定性檢測(cè)限為0.25 μg/kg。ELISA試劑盒檢測(cè)磁珠處理液，平均回收率為92.3%，磁珠處理樣本前處理滿(mǎn)足檢測(cè)需求。定性檢測(cè)能夠根據(jù)需要進(jìn)行快速檢測(cè)，尤其適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方面。

2.7 膠體金免疫層析的定量檢測(cè)

在0.02 mol/L PB中分別加入0、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、4 μg/kg MQCA藥物，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖6所示。

圖6 定性和定量膠體金免疫層析法結(jié)果及定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立Fig.6 The result of qualitative and quantitative CGICA and the normalized standard curve of CGICA for MQCA in quantitative method

曲線(xiàn)方程為y=1.179 2+(4.362 3)/(1+(x/x0)1.145 5)，IC50為0.139 0 μg/kg，定量范圍為0.1～4 μg/kg。該曲線(xiàn)方程可以用二維碼帶入，膠體金免疫層析定量分析儀可直接顯示出檢測(cè)樣本的藥物含量，直接出結(jié)果，免去換算的步驟。根據(jù)檢測(cè)限計(jì)算方法的定量檢測(cè)方法的檢測(cè)限為0.1 μg/kg。豬肉樣本的添加回收結(jié)果表3所示，回收率為89.9%～115.2%，變異系數(shù)為6.8%～11.5%。證明該方法(免疫磁珠結(jié)合膠體金免疫層析檢測(cè))可以用于實(shí)際豬肉樣本的快速定量檢測(cè)。

表3 膠體金免疫層析法定量檢測(cè)回收結(jié)果(n=5)Table 3 Recovery result of the colloidal gold immunoch-romatographic assay in quantitatively detection (n=5)

本文建立的定性和定量膠體金免疫層析方法靈敏度較高(LOD=0.1 μg/L)，是已經(jīng)報(bào)道的TR-FIA方法的1.6倍(LOD=0.16 μg/L)，是傳統(tǒng)ELISA方法的2.8倍和19倍[1, 14](LOD=0.28和1.9 μg/L),是已經(jīng)報(bào)道的膠體金方法的4.9和68倍(LOD=0.49和6.83 μg/L)[3, 16]。同時(shí)結(jié)合免疫磁珠的快速、高特異性和高倍數(shù)富集作用，可作為豬肉中MQCA或者QCA的殘留檢測(cè)技術(shù)。

2.8 膠體金免疫層析方法(定量)與LC-MS/MS測(cè)定結(jié)果比較

根據(jù)隨機(jī)選取的20份市售豬肉，采用膠體金免疫層析方法和LC-MS/MS[22]同時(shí)定量檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如表4所示，其中13份陰性樣本，7份陽(yáng)性樣本。其中，CGICA的檢測(cè)結(jié)果為MQCA+QCA的總量，該方法以MQCA為標(biāo)準(zhǔn)品建立的檢測(cè)方法，檢測(cè)的結(jié)果直觀(guān)以MQCA含量表示。

表4 CGICA和LC-MS/MS對(duì)20份豬肉樣本的檢測(cè)結(jié)果 單位：μg/kg

注：ND表示未檢出。

LC-MS/MS能分別直觀(guān)顯示MQCA和QCA的含量。另外，文中MQCA+QCA的值與LC-MS/MS的值有差異，原因是MQCA的交叉反應(yīng)率為100%，QCA交叉反應(yīng)率為40%。根據(jù)交叉反應(yīng)率計(jì)算知，LC-MS/MS和CGICA檢測(cè)結(jié)果一致性較好，證明建立的CGICA方法準(zhǔn)確，可靠。

3 結(jié)論

本文建立一種方便、快速和靈敏的用于豬肉中MQCA和QCA的定性和定量的膠體金免疫層析方法，定性和定量檢測(cè)限為0.1 μg/L。免疫磁珠簡(jiǎn)化樣本前處理，可高特異性提取豬肉中的MCA和QCA藥物。可在30 min內(nèi)完成樣本的前處理，5 min完成定性定量檢測(cè)，肉眼視覺(jué)直接判斷陰陽(yáng)性(定性)，通過(guò)儀器識(shí)別內(nèi)置二維碼直接顯示檢測(cè)的MQCA和QCA含量，可以根據(jù)需要靈活地選擇檢測(cè)方式，快速方便。本文建立的CGICA與LC-MS/MS的測(cè)量結(jié)果一致性很好，證明該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于豬肉樣本中MQCA和QCA藥物的非法殘留，可為我國(guó)的食品安全檢測(cè)提供一種有效的檢測(cè)手段。