超高效液相色譜法測(cè)定有色稻米中花色苷的含量

趙珊，席清清，李曦，雷欣宇，仲伶俐，黃世群，羅玲，郭靈安，周虹

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估試驗(yàn)室(成都)，四川 成都，610066)

有色稻米是色素沉積在水稻種子的果皮、種皮或糊粉層內(nèi)形成的一種重要的特異水稻種質(zhì)資源，常見的有黑米、紅米和紫米。花青素屬于黃酮類物質(zhì)，它是一種廣泛存在于自然界植物中的水溶性天然色素，在自然狀態(tài)下常與各種單糖形成糖苷，成為花色苷[1]。花色苷具有抗氧化活性[2-4]、抗突變活性[5]、抗癌活性[6]、抗炎活性[7-9]、保護(hù)視力[10]、抗輻射[11]等功能，在食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)都具有巨大的應(yīng)用潛力。有色稻米中含有豐富的花色苷，使得有色稻米的市場(chǎng)需求越來(lái)越大。此外，有色稻糠中也富含花色苷，通過(guò)了解其花色苷的含量有助于對(duì)資源進(jìn)行更充分的發(fā)掘利用。

有色稻米中的花色苷主要有矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素-3-O-葡萄糖苷[12-13]。目前測(cè)定花色苷的檢測(cè)方法主要有可見分光光度法[14]、高效液相色譜法[15]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14, 16]等。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其測(cè)定準(zhǔn)確，檢出限低，適合進(jìn)行低含量樣品的測(cè)定和鑒定未知結(jié)構(gòu)的花色苷，對(duì)于像黑米這類含量較高的樣品來(lái)說(shuō)會(huì)超過(guò)其線性范圍。普通高效液相色譜法是目前測(cè)定花青素、花色苷較多的方法之一，而超高效液相色譜能夠在較寬的線性范圍內(nèi)保持柱效恒定，大幅度改善液相色譜的分析速度、分離度和靈敏度，顯著提高工作效率。

本文以黑米、紫米和紅米為材料，建立花色苷的超高效液相色譜檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米稻谷、紅米稻谷、紫米稻谷均購(gòu)于生產(chǎn)基地；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(≥98%)、芍藥素-3-O-葡萄糖苷(≥98%)，武漢天植生物技術(shù)有限公司；濃鹽酸(優(yōu)級(jí)純)，西隴化工；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)，F(xiàn)isher Scientific；甲酸(色譜純)，CNW；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

1290型超高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司(配紫外檢測(cè)器，用于花色苷測(cè)定)；1100型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司(配二極管陣列檢測(cè)器，用于花色苷光譜掃描)；KQ5200DE型超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；AUY220型電子天平，日本島津公司；UPH-1-20L型實(shí)驗(yàn)室超純水儀，四川優(yōu)普超純科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

將稻谷過(guò)礱谷機(jī)進(jìn)行脫殼，分別將脫殼后的糙米和谷殼米糠磨粉機(jī)磨成粉并過(guò)篩，糙米過(guò)80目篩，谷殼米糠過(guò)40目篩。-20 ℃避光保存。

有色稻米和米糠花色苷的提取：稱取1.0 g(精確到0.000 1 g)糙米粉或米糠樣品于50 mL離心管中，加入10 mL提取液V(甲醇)∶V(1.0 mol/L HCl水溶液)=85∶15，混勻后避光超聲提取30 min，300 0 r/min離心5 min，取上清液，重復(fù)提取1次，合并上清液混勻后過(guò)0.22 μm尼龍膜，裝入棕色樣品瓶中待測(cè)。

有色稻米和米糠中花青素的提取：稱取1.0～3.0 g(精確到0.000 1g)糙米粉或米糠樣品于250 mL具塞三角瓶中，加入50 mL提取液V(無(wú)水乙醇)∶V(水)∶V(濃鹽酸)=2∶1∶1，混勻后避光超聲提取30 min，然后于沸水浴中回流1 h，取出冷卻后，用提取液V(無(wú)水乙醇)∶V(水)∶V(濃鹽酸)=2∶1∶1定容至50 mL后取上清液過(guò)0.22 μm水相濾膜，裝入棕色樣品瓶中待測(cè)。具體步驟參照標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2640—2014 植物源性食品中花青素的測(cè)定高效液相色譜法。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：520 nm；流動(dòng)相A：1%甲酸/水溶液(體積比)，過(guò)0.2 μm水系微孔過(guò)濾膜；流動(dòng)相B：1%甲酸/乙腈溶液(體積比)；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：2.0 μL；梯度洗脫程序：0～1 min，7%～8% B；1～3 min，8%～18% B；3～4.5 min，18%～30% B；4.5～7 min，30%～40% B；7～8 min，40% B；8～9 min，40%～7% B；后運(yùn)行2.5 min。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：分別稱取矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品各5.0 mg(精確到0.01 mg)，用85%甲醇鹽酸溶液V(甲醇)∶V(1 mol/L HCl水溶液)=85∶15溶解并定容至10 mL容量瓶中，即為500 μg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液，于-20 ℃下，貯存于密閉的棕色玻璃瓶中。

混合標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制：將單標(biāo)儲(chǔ)備液混合，并用85%甲醇鹽酸溶液V(甲醇)∶V(1 mol/L HCl水溶液)=85∶15逐級(jí)稀釋成0.5、1.0、5.0、10.0、25.0和50.0 μg/mL濃度的花色苷混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

通常花色苷不太穩(wěn)定，在中性和堿性條件下容易發(fā)生分解，但在偏酸性條件下能較穩(wěn)定地存在。為了解加熱酸水解對(duì)花青素含量測(cè)定的影響，通過(guò)比較直接提取測(cè)定稻米中花色苷含量和將其沸水浴酸水解后測(cè)定花青素含量，結(jié)果見表1，發(fā)現(xiàn)在沸水浴酸水解過(guò)程中花青素有明顯的降解。在黑稻和紫稻樣品中，矢車菊素測(cè)定含量為理論值的57.3%～74.5%，芍藥素測(cè)定含量為理論值的40.0%～60.4%。因此，選擇直接提取稻米中的花色苷后進(jìn)行矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素-3-O-葡萄糖苷的測(cè)定。采用超聲提取法對(duì)樣品中花色苷進(jìn)行提取(提取溶劑：V(甲醇)∶V(1mol/L HCl水溶液)=85∶15；料液比=1∶10；提取溫度：常溫)，將稻米和米糠樣品進(jìn)行超聲避光提取，每次30 min，重復(fù)2次。前處理過(guò)程迅速、簡(jiǎn)便。樣品處理完后裝于棕色的樣品瓶中并盡快完成測(cè)定。

表1 酸水解對(duì)花青素含量測(cè)定的影響Table1 The influence of acid hydrolysis on anthocyanins content determination

注：“-”表示無(wú)數(shù)據(jù)。

2.2 液相條件的確定

由于花青素需要在低pH值的條件分離，結(jié)合文獻(xiàn)[17-18]和前期條件摸索，流動(dòng)相選擇酸性較強(qiáng)的1%甲酸水溶液和1%甲酸乙腈溶液。色譜柱選擇在低pH條件下穩(wěn)定性好的Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱。考慮到峰形和分離效果，將出峰時(shí)間控制在5～7 min，經(jīng)過(guò)反復(fù)優(yōu)化，采用梯度洗脫程序。圖1為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素-3-O-葡萄糖苷的色譜圖，A為標(biāo)準(zhǔn)品，B為稻米樣品。

A-標(biāo)準(zhǔn)品；B-稻米樣品；峰1-矢車菊素-3-O-葡萄糖苷；峰2-芍藥素-3-O-葡萄糖苷?qǐng)D1 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素-3-O-葡萄糖苷色譜圖Fig.1 The chromatograms of cyandin-3-O-glucoside chloride and peonidin-3-O-glucoside chloride

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)花色苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行最大吸收波長(zhǎng)分析，設(shè)置掃描范圍200～600 nm。提取矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素-3-O-葡萄糖苷的紫外可見吸收光譜圖(圖2)，得到矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素-3-O-葡萄糖苷分別在275 nm和520 nm左右有較強(qiáng)的吸收峰，其中兩者在520 nm處吸收強(qiáng)度更強(qiáng)。另外，結(jié)合前人的研究結(jié)果[16, 19-20]，這里選擇520 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1-矢車菊素-3-O-葡萄糖苷；2-芍藥素-3-O-葡萄糖苷?qǐng)D2 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素-3-O-葡萄糖苷紫外可見吸收光譜圖Fig.2 The UV-Vis absorption spectrum of cyandin-3-O-glu-coside chloride and peonidin-3-O-glucoside chloride

2.4 方法的線性、檢出限和定量限

將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋得到0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL濃度的花色苷混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，依次進(jìn)超高效液相色譜儀進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在0.5～50.0 μg/mL線性關(guān)系良好。儀器的檢出限和定量限分別對(duì)應(yīng)儀器3和10倍信噪比，方法檢測(cè)線和定量限以稱樣量為1.00 g，定容體積為20 mL進(jìn)行計(jì)算得出。線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、儀器和方法檢出限、定量限見表2。

表2 花色苷的線性關(guān)系、檢出限和定量限Table 2 Liner equations, correlation, LOD and LOQ of anthocyanins

2.5 回收率和精密度

以質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL的混標(biāo)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，根據(jù)保留時(shí)間和峰面積分別計(jì)算精密度，兩種花色苷的保留時(shí)間RSD分別為0.06%和0.12%，峰面積RSD分別為0.48%和1.27%，表明儀器精密度良好，結(jié)果見表3。

為了評(píng)價(jià)方法的可靠性，選擇黑稻米、黑稻糠、紫稻米、紫稻糠、紅稻米和紅稻糠樣品為加標(biāo)基質(zhì)進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表4所示，每個(gè)添加水平重復(fù)6次。矢車菊素-3-O-葡萄糖苷回收率在93.0%～98.5%，RSD在0.33%～3.50%；芍藥素-3-O-葡萄糖苷回收率在96.0%～111.7%，RSD在0.42%～2.18%。結(jié)果表明，該方法的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性良好，適用于有色稻中花色苷的檢測(cè)分析。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)(n=6)Table 3 Result of precision experiments (n=6)

表4 回收率實(shí)驗(yàn)(n=6)Table4 Results of recovery test (n=6)

2.6 樣品的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)對(duì)四川重慶地區(qū)的4個(gè)黑米樣品、1個(gè)紫米樣品和5個(gè)紅米樣品的糙米和米糠進(jìn)行花色苷的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表5。由結(jié)果可知，黑米中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量為0～726.64 mg/kg，芍藥素-3-O-葡萄糖苷的含量為0～324.63 mg/kg，總量為0～1 051.27 mg/kg；黑米糠中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量為46.90～134.74 mg/kg，芍藥素-3- O-葡萄糖苷的含量為15.10～72.08 mg/kg，總量為74.06～206.82 mg/kg。紫米中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量為220.00 mg/kg，芍藥素-3-O-葡萄糖苷的含量為76.18 mg/kg，總量為296.18 mg/kg；紫米糠中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量為78.20 mg/kg，芍藥素-3-O-葡萄糖苷的含量為37.95 mg/kg，總量為116.15 mg/kg。紅米中均未檢出矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素素-3-O-葡萄糖苷，紅米糠中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量為0～59.94 mg/kg，未檢出芍藥素-3-O-葡萄糖苷。研究表明[21-22]，黑米花色苷分布從米粒表面至內(nèi)部呈急劇遞減，精碾后的精米近乎白米，其花色苷含量極低。陳廷文[23]發(fā)現(xiàn)，水稻花色苷含量與谷粒顏色之間有一定的相關(guān)關(guān)系，穎殼色深褐而糙米色深黑，花色苷含量高。黑米1-米樣品未檢出矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素素-3-O-葡萄糖苷，可能是由于樣品的顏色呈淡黃色，和其他幾個(gè)黑米樣品深黑色差異較大。另外，花色苷類物質(zhì)在稻米加工過(guò)程中，隨著米皮去除會(huì)有部分損失，因此加工過(guò)程越少抗氧化成分保留越多。

表5 黑米、紫米和紅米中花色苷的含量(n=3)Table 5 The content of anthocyanins in black rice, purple rice and red rice

續(xù)表5

注：ND為未檢出。

不同的黑米種質(zhì)其花色苷組成和含量都有較大的差異。RYU等[24]從10個(gè)不同黑米樣品中檢測(cè)到矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素素-3-O-葡萄糖苷兩種花色苷，其總花色苷含量(以全谷計(jì))為0～490 mg/100g。本研究中黑米樣品花色苷總量為0～1 051.27 mg/kg，黑米糠樣品中花色苷總量為74.06～206.82 mg/kg。本研究發(fā)現(xiàn)黑米、黑米糠、紫米和紫米糠中花色苷主要組成是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素素-3-O-葡萄糖苷，其中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷占總量的59.3%～82.0%，這與YAWADIO等[25]和孔令瑤等[26]的研究一致。由不同顏色的水稻樣品進(jìn)行比較得知，黑米的花色苷含量最高，黑米1樣品除外，其次是紫米，紅米中未檢測(cè)到花色苷，只有部分紅米糠中檢測(cè)到花色苷。由糙米和米糠樣品進(jìn)行比較得知，大部分黑米和紫米中花色苷的含量大于黑米糠和紫米糠。

3 結(jié)論

建立了有色稻米中花色苷的超高效液相色譜檢測(cè)方法，使用鹽酸甲醇溶液超聲提取有色稻米花色苷能有效避免花色苷水解等過(guò)程發(fā)生降解，采用超高效液相色譜—紫外可見檢測(cè)器對(duì)有色稻米和米糠中主要花色苷矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素-3-O-葡萄糖苷進(jìn)行定量檢測(cè)。方法驗(yàn)證結(jié)果表明，該方法能快速、準(zhǔn)確地對(duì)有色稻中糙米和米糠的花色苷進(jìn)行定性定量測(cè)定，方法穩(wěn)定、可靠。

對(duì)四川重慶地區(qū)的4個(gè)黑米、1個(gè)紫米和5個(gè)紅米的糙米和米糠進(jìn)行花色苷的測(cè)定，結(jié)果表明：黑米、黑米糠、紫米和紫米糠樣品中花色苷主要組成是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素素-3-O-葡萄糖苷，其中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷占總量的59.3%～82.0%。黑米花色苷總量為0～1 051.27 mg/kg，黑米糠花色苷總量為74.06～206.82 mg/kg；紫米花色苷總量為296.18 mg/kg，紫米糠花色苷總量為116.15 mg/kg；紅米中未檢出矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素-3-O-葡萄糖苷，部分紅米糠檢出矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，含量為0～50.94 mg/kg。