MEK和ERK蛋白在腎癌骨轉(zhuǎn)移患者中的表達及相關(guān)性分析

施柳輝，施飛，戴軍，何竑超#，何威，徐丹楓

1民航上海醫(yī)院泌尿外科，上海200336

2上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院泌尿外科，上海200025

腎癌骨轉(zhuǎn)移是影響腎癌患者臨床預后的重要因素。流行病學調(diào)查顯示，近年來腎癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率呈持續(xù)性上升的趨勢[1]。臨床上發(fā)生腎癌骨轉(zhuǎn)移能夠?qū)е禄颊卟∷缆噬仙?年生存率顯著下降，致殘風險升高[2]。腫瘤相關(guān)因子的改變能夠影響腫瘤細胞對骨質(zhì)細胞的黏附能力，增加發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的風險。促分裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）和胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）能夠改變腫瘤細胞對血管內(nèi)皮或淋巴結(jié)的黏附能力，進而促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[3-4]。近年來已有研究證實，MEK和ERK蛋白在卵巢癌、甲狀腺癌、肝癌、腎癌等惡性腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮了重要的作用，MEK和ERK蛋白的高表達是導致患者臨床分期晚、腫瘤細胞分化程度下降、術(shù)后復發(fā)風險升高的重要因素[5-6]，但目前尚缺乏MEK和ERK蛋白表達與腎癌骨轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究。本研究回顧性分析80例原發(fā)性腎癌患者的臨床資料，探討MEK和ERK蛋白表達與腎癌骨轉(zhuǎn)移的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2015年1月至2017年6月于民航上海醫(yī)院治療的原發(fā)性腎癌患者的臨床資料。納入標準：①均經(jīng)病理組織學確診為原發(fā)性腎癌；②術(shù)前未行靶向治療、放療、化療或免疫治療。排除標準：臨床或病理資料不完整者。根據(jù)納入和排除標準，本研究共納入80例原發(fā)性腎癌患者。80例患者中，男46例，女34例；年齡38～67歲，中位年齡51歲；病理類型：透明細胞癌64例，乳頭狀細胞癌9例，嫌色細胞癌7例；有骨轉(zhuǎn)移12例，無骨轉(zhuǎn)移68例。收集患者的腎癌原發(fā)灶組織、癌旁組織（距腫瘤邊緣＞5 cm）、骨轉(zhuǎn)移灶組織標本。

1.2 免疫組織化學染色

石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫避光放置10 min，加入10 mmol/L pH 6.0的枸櫞酸鈉緩沖液2 ml進行抗原修復，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗5 min，滴加正常山羊或兔血清封閉處理，37℃，15 min。用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加一抗，37℃，2 h；滴加生物素化二抗，37℃，40 min；PBS沖洗5 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復染，加拿大樹膠（或中性樹膠）封片。

1.3 結(jié)果判斷

MEK和ERK蛋白表達于細胞質(zhì)或細胞核中，陽性表現(xiàn)為細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。采用雙評分半定量法進行評分[6]，依據(jù)陽性細胞比例評分：陽性細胞比例＜5%為1分，5%～50%為2分，≥51%為3分；依據(jù)染色強度評分：未著色為1分，淡黃色為2分，黃色為3分，棕黃色為4分。最終得分為陽性細胞比例和染色強度評分之積，≤4分為陰性表達，＞4分為陽性表達。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中MEK和ERK蛋白陽性表達率的比較

有骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶和無骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白的陽性表達率均高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；有骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶和無骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。骨轉(zhuǎn)移灶中MEK和ERK蛋白的陽性表達率均高于無骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶和有骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表 1）

表1 不同腎組織中MEK和ERK蛋白陽性表達情況的比較[ n（%）]

2.2 不同病理類型腎癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白陽性表達率的比較

透明細胞癌、乳頭狀細胞癌和嫌色細胞癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同病理類型腎癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白的陽性表達情況[ n（%）]

2.3 MEK和ERK蛋白表達的相關(guān)性分析

骨轉(zhuǎn)移灶中MEK和ERK蛋白表達無相關(guān)性（P＞0.05），無骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白表達呈正相關(guān)（rs=0.707，P＜0.05），有骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白表達也呈正相關(guān)（rs=0.897，P＜0.05）。（表3～表5）

表3 骨轉(zhuǎn)移灶中MEK和ERK蛋白表達的相關(guān)性

表4 無骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白表達的相關(guān)性

表5 有骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白表達的相關(guān)性

3 討論

腎癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的機制較為復雜，但一般認為與自身遺傳易感性、骨質(zhì)局部解剖結(jié)構(gòu)或者分子生物學改變等有關(guān)。特別是在病程較長、臨床分期較晚的腎癌患者中，骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生風險明顯升高[7]。現(xiàn)階段臨床上主要通過影像學檢查評估骨轉(zhuǎn)移的風險，但單純磁共振檢查或者X線檢查評估骨轉(zhuǎn)移的價值較為局限。ERK蛋白相關(guān)血清學指標在評估惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移風險中具有重要的指導價值，具有檢查方便、費用較低等優(yōu)勢。通過對腎癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機制的研究，能夠為臨床上腎癌骨轉(zhuǎn)移的免疫靶向治療提供新的參考靶點。

MEK和ERK蛋白是重要的腫瘤相關(guān)蛋白，其上游啟動子轉(zhuǎn)錄活性的增加能夠提高ERK蛋白的翻譯活性，使腫瘤細胞的生物學特征明顯改變[8]。ERK蛋白上調(diào)能夠通過影響腫瘤細胞的浸潤能力而增加腫瘤細胞的擴散或轉(zhuǎn)移風險。基礎(chǔ)方面的研究表明，ERK蛋白翻譯增加是導致骨干骺端骨質(zhì)細胞密度改變、局部干骺端新生血管通透性改變、血流緩慢的重要因素，而相關(guān)病理過程的發(fā)生均可以增加腎癌細胞發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的風險[5]。另外，MEK/ERK信號通路的激活能夠誘導趨化因子的富集，特別是CXCL4、CXCL3等的上調(diào)能夠誘導腎癌細胞黏附分子表達水平的變化，增加腫瘤細胞黏附骨質(zhì)細胞、骨小梁的可能[9-10]。有研究認為，MEK和ERK蛋白高表達是促進腎癌患者臨床分期進展的重要因素[10]，但關(guān)于腎癌原發(fā)病灶及骨轉(zhuǎn)移病灶中MEK和ERK蛋白的分析研究不足。

本研究結(jié)果顯示，有骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶和無骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白的陽性表達率均高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示MEK和ERK蛋白均可能參與了腎癌的發(fā)生過程，考慮可能的原因如下[11-12]：①MEK蛋白高表達能夠促進腫瘤細胞DNA的擴增，導致腫瘤細胞突破基底膜的風險增加；②ERK蛋白高表達能夠?qū)е履I癌上皮細胞的異型性改變，增加腫瘤細胞的核分裂象。本研究結(jié)果表明，在不同病理類型的腎癌組織中，MEK和ERK蛋白的表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示MEK和ERK蛋白表達的差異并不會影響腫瘤細胞的病理類型，這可能是因為腫瘤細胞的病理類型主要與腫瘤細胞分化過程中誘導分子的調(diào)控作用有關(guān)。秦彩朋等[13]研究表明，腎癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白的表達水平均低于骨轉(zhuǎn)移灶（P＜0.05）。本研究結(jié)果表明，骨轉(zhuǎn)移灶中MEK和ERK蛋白的陽性表達率均高于無骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶和有骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶（P＜0.05），提示MEK和ERK蛋白的表達水平與骨轉(zhuǎn)移過程有關(guān)。MEK和ERK蛋白對于骨轉(zhuǎn)移發(fā)生的影響，主要由于二者可以增加骨小梁局部血管內(nèi)皮的通透性，從而導致腫瘤細胞突破血管內(nèi)皮，使其黏附骨小梁的可能性增大，同時ERK蛋白還可誘導骨源性趨化因子的生成，啟動腫瘤細胞的特異性黏附過程[14]。本研究的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在無骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶和有骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白表達均呈正相關(guān)（P＜0.05），提示在腎癌發(fā)病的早期，MEK和ERK蛋白發(fā)揮了重要的協(xié)同刺激作用；而在骨轉(zhuǎn)移灶中，MEK和ERK蛋白表達無相關(guān)性。

綜上所述，腎癌骨轉(zhuǎn)移灶中MEK和ERK蛋白的陽性表達率均高于原發(fā)灶，MEK和ERK蛋白可能參與了腎癌骨轉(zhuǎn)移過程，值得進一步研究。