切取活檢對兔VX 2舌癌移植瘤生長及轉移的影響及其機制研究

葉麗君，周新春，殷小佳，尚裕，魏巍，趙青

湖北醫藥學院附屬襄陽市第一人民醫院1腫瘤科，2病理科，3口腔科，湖北 襄陽441000

舌癌（carcinoma of tongue）是臨床中常見的口腔惡性腫瘤，具有惡性程度高、早期頸部轉移的特點。現階段舌癌的發病率逐年升高，而病理診斷是確診該病的金標準[1]。臨床工作中，對于疑似病例往往先進行切取活檢，確診后再行擇期手術。但有研究指出，切取活檢會促進多種鱗癌細胞的增殖和轉移，但具體機制仍不清楚[2]。本研究通過構建大白兔VX2舌癌移植瘤模型，觀察切取活檢對腫瘤生長及轉移的影響，并初步探討其機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

VX2鱗狀細胞癌瘤株由北京協和醫院病理科獲得，新西蘭大白兔購自武漢大學生命科學院動物實驗中心，戊巴比妥鈉（粉劑）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司，抗核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體均購自艾博抗（上海）貿易有限公司，SP免疫組化檢測試劑盒購自中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 制作荷瘤兔

取生長良好的腫瘤細胞，臺盼藍染色進行活細胞計數，調至1×108/ml活細胞密度；兔術前禁食12 h，采用3%戊巴比妥耳緣靜脈注射進行全麻，仰臥位固定于兔臺，取兔后腿內側部位脫毛后注入1 ml腫瘤細胞懸液，4周左右在接種部位能觸及直徑3～4 cm的實性包塊，即為荷瘤兔。

1.3 兔VX 2移植瘤模型的構建及切取活檢處理

切取荷瘤兔的腫瘤組織，去除肌肉組織及中心處的壞死組織，使用含雙抗的Hank’s液沖洗2遍后使用鋒利的眼科剪剪碎，使用0.25%胰酶消化液制備腫瘤細胞懸液，200目細胞篩過濾，制備細胞密度為5×108/ml的腫瘤細胞懸液。取48只雄性新西蘭大白兔，體重2.7～3.3 kg，全麻后固定于兔臺，使用5號皮試細針頭在舌側緣中1/3處舌黏膜下注入0.1 ml腫瘤細胞懸液，3周后將舌部成瘤兔（共45只）按體重由小到大進行編號（1～45），采用隨機數字表法將其分為實驗組23只及對照組22只。實驗組全麻后切取腫瘤組織4 mm×4 mm×4 mm，4%多聚甲醛保存，對照組只進行全麻處理。

1.4 取材及病理學觀察

術后第1、3、7、14、21天無痛處死兔子（前4次各組均取4只，最后1次全部處死），記錄每只兔子體重，切取完整舌部腫瘤及雙側頜下淋巴結，測量大小后將組織置于10%多聚甲醛中固定。將淋巴結標本切片于蘇木素-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色后觀察是否有轉移。

1.5 原發灶生長情況大體觀察

在第1、3、7、14、21天觀察并記錄兔子舌部腫瘤的大小。將兔子舌體牽出，游標卡尺測量腫瘤的長、寬、高，并計算腫瘤體積[3]。設定活檢前腫瘤體積（V1）、活檢取下腫瘤的體積（V2）、處死后取下腫瘤的體積（V3）。實驗組的腫瘤體積變化：V實驗=V3+V2-V1，對照組的腫瘤體積變化：V對照=V3-V1。

1.6 免疫組化染色檢測蛋白表達情況

采用免疫組化（SP）法檢測舌部腫瘤NF-κB、MMP-9、VEGF蛋白的表達情況。NF-κB、MMP-9、VEGF的抗體濃度均為1∶150，二氨基聯苯胺（3，3N-diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復染后封片觀察，行半定量分析。細胞質著色細胞為陽性細胞，按著色強度及陽性細胞所占比例評價表達情況。①按著色強度：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，褐色為3分。②按陽性細胞所占比例：每個標本選6個高倍視野，計數每個視野下的細胞數及陽性細胞數，計算陽性細胞所占比例，＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。將兩項結果相加，≥1分為陽性表達，≥4分為高表達，＞5分為過表達。

1.7 統計學分析

采用SPSS 21.0統計-軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗；計數資料以頻數表示，組間比較采用Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兔VX 2舌癌移植瘤切取活檢動物模型的建立

經舌部注射腫瘤細胞3周后，48只新西蘭大白兔有45只（93.75%）舌部成瘤。實驗組于術后第15、20天各死亡1只，對照組于術后第19天死亡1只，死亡動物取材，并計入臨近時間點。

2.2 術后原發灶生長情況的比較

兔子注射腫瘤細胞后第1周未能觀察到明顯變化，第2周能看到舌部有小包塊形成，質韌，第3周瘤體迅速增長，體積明顯變大。實驗組行切取活檢術，術后第1周腫瘤原發灶與對照組比較，未見明顯異常，術后第2周可見實驗組腫瘤原發灶體積增長明顯快于對照組，術后第3周實驗組腫瘤影響兔子進食，消瘦明顯。術后第3、7天，兩組腫瘤原發灶體積變化比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；術后第14天及第21天，實驗組腫瘤原發灶體積變化均明顯大于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）（表1）。

表1 腫瘤原發灶切取活檢術后對照組與實驗組腫瘤原發灶體積變化的比較（mm 3，±s）

表1 腫瘤原發灶切取活檢術后對照組與實驗組腫瘤原發灶體積變化的比較（mm 3，±s）

組別實驗組對照組t值P值2 1.8±8.9 1 9.2±7.7 0.4 4 2 0.7 2 4 1 0 2.4±1 1.6 8 8.7±1 1.3 1.1 7 0 0.1 3 2 1 6 3.2±1 2.5 1 2 1.0±1 1.2 5.2 6 0 0.0 0 1 2 0 4.0±1 7.3 1 5 2.0±1 0.3 5.3 4 9 0.0 0 1第3天（n實=4，n對=4）第7天（n實=4，n對=4）第1 4天（n實=5，n對=4）第2 1天（n實=6，n對=6）

2.3 HE染色觀察

對取下的頜下淋巴結進行HE染色，顯微鏡下觀察腫瘤轉移情況，可見實驗組（共46個淋巴結）有7個淋巴結能見到腫瘤轉移，而對照組（共44個淋巴結）有2個淋巴結能見到腫瘤轉移，經Fisher確切概率法比較，差異無統計學意義（P=0.182）。

2.4 免疫組化染色觀察

對原發灶進行免疫組化染色觀察，結果顯示，實驗組NF-κB、MMP-9、VEGF的陽性表達水平均明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表 2）

表2 兩組舌部腫瘤NF-κB、MMP-9、VEGF表達水平的比較（±s）

表2 兩組舌部腫瘤NF-κB、MMP-9、VEGF表達水平的比較（±s）

組別實驗組（n=23）對照組（n=22）t值P值NF-κB 4.2±1.1 1.9±0.9 7.657 0.000 MMP-9 4.4±1.3 1.8±1.0 7.495 0.000 VEGF 3.4±0.9 1.9±1.2 4.758 0.000

3 討論

病變組織切取活檢被認為是腫瘤診斷的金標準。在臨床工作中，往往需要對異常組織進行術前病理活檢來確定是否進行手術治療以及手術切除的范圍。但有研究顯示，切取活檢會加速腫瘤的發展及轉移[4]；也有研究認為切取活檢短期內對病變部位無不良影響[5]。切取活檢對腫瘤的生長及轉移有何影響，其具體的分子機制仍不清楚。

本實驗采取改良腫瘤細胞懸液注入法構建大白兔舌癌動物模型[6-7]，實驗中成瘤率達93.75%。與化學誘導法相比，本方法成瘤時間短，在第2周即可見到注入部位有瘤體形成；注入部位及注入的腫瘤細胞數目可控，使形成的腫瘤組織的部位、所需時間、腫瘤大小較接近，有利于后期的實驗研究。

本研究結果顯示，實驗組腫瘤生長速度明顯快于對照組，表明切取活檢會加速腫瘤原發灶的生長。盡管實驗組的淋巴結轉移數高于對照組，但兩組比較，差異無統計學意義。但劉濟遠等[8]認為切取活檢會加速腫瘤原發灶的增長和淋巴結轉移，與本實驗的結果不完全一致，這可能是由于實驗選取的動物不一致，所觀察的腫瘤不同所導致的。

NF-κB是機體中一個重要的炎性信號因子，在腫瘤中也伴有多條炎癥信號通路的激活[9]。VEGF參與了血管的生成過程，與腫瘤中微循環的形成有關并能促進腫瘤的轉移[10]。MMP能降解細胞外基質的蛋白成分，破壞細胞間的連接，促進腫瘤的侵襲與轉移[11]。本研究發現，實驗組舌部腫瘤中的NF-κB、VEGF、MMP-9的陽性表達水平均明顯高于對照組，提示切取活檢可能通過促進NF-κB、VEGF、MMP-9的表達來促進腫瘤增長。據此推測切取活檢部位可能會出現炎性反應，使NF-κB的表達升高，從而上調VEGF的表達促進腫瘤內血管的形成，使腫瘤的增長加快；同時使MMP-9的表達升高，破壞了細胞間的連接，使腫瘤細胞能浸潤到周圍正常組織內，使腫瘤面積增大。有研究顯示，切取活檢的結果使患者的心理壓力增加，長期的心理焦慮會影響體內的多種激素分泌[12]，干擾了機體的免疫防御機制，從而促進了腫瘤的生長和轉移。

綜上所述，切取活檢能夠促進腫瘤的生長，但在臨床工作中常先進行活檢再擇期手術。因此，尋找一種能替代病理活檢的新診斷方式或減輕切取活檢對腫瘤的影響將是以后的研究方向。