ABT199通過(guò)增加Drp-1依賴的線粒體分裂誘導(dǎo)人皮膚鱗癌A431細(xì)胞凋亡

袁勝華，張玉榮，李浩運(yùn)，宋靜卉

皮膚癌是臨床上比較常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人們的生命和健康。皮膚癌的主要病理類型為：基底細(xì)胞癌、惡性黑色素瘤和鱗狀細(xì)胞癌等。其中鱗狀細(xì)胞癌最為常見(jiàn)[1]。研究顯示抗凋亡蛋白Bcl-2在鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞存活并降低其對(duì)凋亡反應(yīng)的敏感性[2]。Bcl-2家族成員主要包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，分別促進(jìn)或抑制細(xì)胞死亡。抗凋亡蛋白主要包括Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1等，促凋亡蛋白主要包括Bax、Bak、Bim和Bid等[3]。其中抗凋亡蛋白Bcl-2在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，并充當(dāng)著一個(gè)“凋亡開(kāi)關(guān)”的功能。線粒體是Bcl-2家族蛋白的主要作用靶點(diǎn)之一，最新研究表明其除了調(diào)控線粒體外膜通透性外，也調(diào)控線粒體動(dòng)力學(xué)（線粒體融合和分裂）[4]。

ABT199是一種高效的特異性Bcl-2抑制劑，具有良好的抗腫瘤效應(yīng)，并且不會(huì)引起血小板的減少[5,6]。Fan等[7]研究已證實(shí)Bcl-2抑制劑通過(guò)增加線粒體分裂可增加人膽管癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。然而目前關(guān)于ABT199在人皮膚鱗狀細(xì)胞癌凋亡中的作用研究甚少。本研究采用鱗癌A431細(xì)胞為研究對(duì)象，從體外水平觀察ABT199對(duì)A431細(xì)胞活性和凋亡的影響并探討其分子機(jī)制，旨在揭示ABT199通過(guò)增加線粒體分裂誘導(dǎo)A431細(xì)胞凋亡的新機(jī)制，從而為鱗癌的治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系A(chǔ)431購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞所，DMEM（高糖）培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。ABT199由Med Chem Express公司提供。線粒體分裂抑制劑-1 （mitochondrial division inhibitor-1，Mdivi-1）購(gòu)自Selleck Chemicals公司。Mito-Tracker Red購(gòu)自Invitrogen公司。Muse?細(xì)胞分析儀、Muse凋亡試劑盒和Muse線粒體膜電位試劑盒購(gòu)自Merck Millipore公司。線粒體提取試劑盒、ECL發(fā)光顯色液購(gòu)自碧云天公司。線粒體分裂蛋白（mitochondrial dynamin-related protein-1，Drp-1）抗體、線粒體內(nèi)參抗體（COX IV）抗體、β-actin抗體、cleaved caspase-3抗體、cleaved caspase-9抗體及其對(duì)應(yīng)二抗均購(gòu)自Proteintech 公司。聚二偏氟乙烯板（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（0.45 μm）購(gòu)自Millipore公司。Nacl和無(wú)水乙醇等常規(guī)化學(xué)試劑購(gòu)自北京化工廠。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代 使用完全型DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)A431細(xì)胞系，放入37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況及培養(yǎng)基顏色更換培養(yǎng)液或傳代。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右融合時(shí)棄去培養(yǎng)基，使用已經(jīng)高壓滅菌的1×磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗細(xì)胞2次，棄去PBS，加入37 ℃預(yù)熱的0.04%胰蛋白酶（簡(jiǎn)稱胰酶）消化細(xì)胞。然后將培養(yǎng)瓶放入孵箱中，期間間斷取出培養(yǎng)瓶觀察，當(dāng)細(xì)胞失去彼此間連接，從多角形逐漸變圓后加入DMEM培養(yǎng)液以終止胰蛋白酶的消化，使用吸管吹打細(xì)胞，直至細(xì)胞完全被吹下來(lái)。將細(xì)胞懸液移至離心管中。室溫下800 r/min，離心5 min，有效離心半徑15 cm。棄去上清液，按照1∶3～1∶5比例傳代至新的培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A431細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將收集到的細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為8×104個(gè)/ml，每孔100 μl接種于96孔板中，實(shí)驗(yàn)設(shè)1個(gè)陰性對(duì)照和8個(gè)藥物濃度，每一濃度均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，周圍孔用無(wú)菌的PBS填充。37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱孵育。次日，對(duì)照孔更換培養(yǎng)基，8個(gè)加藥孔分別用DMEM配制不同濃度的ABT199（1.25 μM、2.5 μM、5 μM、7.5 μM、10 μM、15 μM、20 μM、30 μM）工作液，加藥完成后，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，每孔加入20 μl MTT （5 mg/ml），繼續(xù)孵育4 h，用1 ml注射器小心吸去上清，每孔加入二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μl，振蕩10 min。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)下各孔的吸光度（OD值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞活性=（1－加藥孔OD值/對(duì)照孔OD值）×100%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以藥物濃度為橫軸，細(xì)胞活性為縱軸，繪制細(xì)胞活性變化曲線，計(jì)算細(xì)胞活性抑制率達(dá)到50%時(shí)的藥物劑量（IC50）作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用藥濃度。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A431細(xì)胞接種于24 孔板中，接種濃度約為4×104個(gè)細(xì)胞/孔，加入不同濃度的ABT199作用24 h，胰酶消化，收集細(xì)胞，800 r/min，離心5 min，有效離心半徑15 cm，然后棄去上清液，緩緩加入適量無(wú)血清 DMEM培養(yǎng)液（調(diào)整細(xì)胞濃度細(xì)胞濃度約為1×106/ml），用手指輕彈將細(xì)胞懸液混勻，將細(xì)胞懸液與Muse?Annexin-V凋亡細(xì)胞檢測(cè)試劑 1∶1 混勻，室溫避光孵育25 min，處理好的樣本用Muse?細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測(cè)，分析不同處理組中細(xì)胞凋亡率的變化。

1.2.4 共聚焦顯微鏡檢測(cè)線粒體分裂對(duì)數(shù) 生長(zhǎng)期A431細(xì)胞按照4×104個(gè)/孔接種于24孔板（提前把高壓過(guò)的1 cm2蓋玻片放入其中）內(nèi)，37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到70%融合時(shí)，10 μM ABT737和/或Mdivi-1作用24 h。棄掉培養(yǎng)液，將細(xì)胞用0.1 M PBS洗3次后。MitoTracker Red 250 μM作用于細(xì)胞30 min。棄掉染色液，將細(xì)胞用0.1 M PBS洗3次，每次3 min。隨后用1∶500稀釋好的Hoechst33342染料孵育2 min。0.01% Triton 0.01 M PBS洗3次，5 min/次。小心將細(xì)胞面朝下放置在準(zhǔn)備好的載玻片上，利用水性封片劑（甘油∶雙蒸水=1∶9）封片，注意避光。共聚焦顯微鏡下采集圖像。MitoTracker Red激發(fā)波長(zhǎng)575 nm，發(fā)射波長(zhǎng)590 nm。

1.2.5 Western blot檢測(cè)caspase-3和caspase-9的活化及Cyto C和Drp-1的線粒體移位 ABT737和/或Mdivi-1處理A431細(xì)胞24 h后，提取全細(xì)胞蛋白或通過(guò)碧云天試劑盒分離線粒體蛋白和胞漿蛋白。Bradford法測(cè)蛋白濃度，取待測(cè)樣本按30 μg上樣，15%二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳常規(guī)電泳、將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉、一抗4℃過(guò)夜，二抗溫育2 h，用0.01 mol/L的PBS洗膜3次，1次15 min，2次5 min，加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色液進(jìn)行顯影。數(shù)據(jù)采用天能圖像分析系統(tǒng)及Quantity One軟件進(jìn)行分析。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位 不同藥物處理后，常規(guī)培養(yǎng)6 h。用胰酶消化細(xì)胞，隨后800 r/min、離心5 min，有效離心半徑15 cm，并用100 μl 培養(yǎng)液重懸。取細(xì)胞懸液100 μl和MitoPotential dye染料95 μl放入1.5 ml 環(huán)氧樹(shù)脂（epoxide，EP）管，并輕微混勻，37℃避光孵育20 min。再向EP管中加入5 μl的7-氨基放線菌素（7-aminoactinomycin D，7-AAD），室溫避光孵育5 min。Muse流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的線粒體膜電位變化情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ABT199對(duì)A431細(xì)胞活性的影響 由圖1 MTT結(jié)果可知，ABT199能以劑量依賴的方式抑制A431細(xì)胞活力（P＜0.05），24 h的IC50值為（10.33±0.93）μM。因此，本研究選用3個(gè)濃度梯度的ABT199（5 μM、10 μM、15 μM）作用細(xì)胞24 h。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果進(jìn)一步表明ABT199可誘導(dǎo)A431細(xì)胞的凋亡（P＜0.05，圖2）。

2.2 ABT199對(duì)線粒體長(zhǎng)度變化的影響 共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示ABT199能誘導(dǎo)線粒體長(zhǎng)度減短，說(shuō)明ABT199能誘導(dǎo)A431細(xì)胞發(fā)生線粒體分裂；而Mdivi-1可減弱ABT199誘導(dǎo)的線粒體分裂（圖3）。Western blot結(jié)果顯示ABT199誘導(dǎo)A431細(xì)胞胞漿蛋白中Drp-1表達(dá)下降，而線粒體蛋白中Drp-1表達(dá)上升（圖4）。

2.3 ABT199誘導(dǎo)A431細(xì)胞線粒體途徑的凋亡 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明ABT199能誘導(dǎo)A431細(xì)胞線粒體膜電位（△Ψm）下降（圖5），而與ABT199組相比，Mdivi-1聯(lián)合ABT199能增加線粒體膜電位。提取A431細(xì)胞線粒體和胞漿蛋白分析Cyto C的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示Mdivi-1減弱了ABT199誘導(dǎo)的Cyto C從線粒體釋放至胞漿（圖6）。提取全細(xì)胞蛋白分析caspase-3和caspase-9的活化水平發(fā)現(xiàn)Mdivi-1能減弱ABT199誘導(dǎo)的activated caspase-3和activated caspase-9的表達(dá)上調(diào)（圖7）。

圖1 ABT199對(duì)A431細(xì)胞活力的影響

圖2 ABT199對(duì)A431細(xì)胞凋亡的影響

圖3 ABT199對(duì)線粒體長(zhǎng)度變化的影響

圖4 ABT199對(duì)Drp-1表達(dá)的影響

圖5 ABT199對(duì)線粒體膜電位的影響

圖6 ABT199對(duì)Cyto C表達(dá)的影響

3 討 論

圖7 ABT199對(duì)activated caspase-3和activated caspase-9表達(dá)的影響

Bcl-2家族中抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之間的失衡是腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要原因，同時(shí)也是標(biāo)志性事件。因此，Bcl-2抗凋亡蛋白成為腫瘤治療非常重要的分子靶點(diǎn)。Bcl-2在皮膚鱗癌中廣泛表達(dá)，顏芹[8]報(bào)道皮膚癌中Bcl-2的表達(dá)水平與凋亡敏感性呈負(fù)相關(guān)。ABT199是Bcl-2的特異性小分子抑制劑，其可以選擇地結(jié)合到Bcl-2蛋白的疏水凹槽上，通過(guò)間接或直接的方式激活Bax/Bak，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。臨床前期研究已經(jīng)表明ABT199能誘導(dǎo)Bcl-2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞凋亡，其可以顯著地誘導(dǎo)慢性淋巴細(xì)胞白血病和非霍奇金氏淋巴瘤細(xì)胞凋亡[9]。本研究結(jié)果表明ABT199能以劑量依賴性的方式抑制鱗狀皮膚癌A431細(xì)胞活力并誘導(dǎo)其凋亡。

在真核細(xì)胞內(nèi)，線粒體不斷地發(fā)生分裂和融合，兩者一般保存著動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)兩個(gè)過(guò)程失衡時(shí)就會(huì)改變線粒體的形態(tài)，從而抑制或促進(jìn)凋亡。線粒體分裂可以通過(guò)減弱線粒體網(wǎng)絡(luò)的連貫性和減少三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的產(chǎn)生抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。而線粒體融合能通過(guò)維持線粒體的完整性促進(jìn)新陳代謝和生物能量轉(zhuǎn)換[10]。研究表明Bcl-2蛋白家族調(diào)控著線粒體動(dòng)力學(xué)[11]。Drp-1是調(diào)控線粒體分裂的重要蛋白之一。在正常生理狀態(tài)下，Drp-1主要定位在胞漿內(nèi)；而在分裂信號(hào)刺激下，Drp-1迅速轉(zhuǎn)位至線粒體并促進(jìn)線粒體分裂。Mdivi-1是Drp-1的特異性抑制劑，它主要通過(guò)變構(gòu)調(diào)節(jié)阻斷Drp-1的ATP酶活性和自組裝，從而抑制Drp-1的功能。Drp-1是線粒體分裂的標(biāo)志性蛋白，一旦發(fā)生分裂，Drp-1會(huì)被Fis1和Mff招募到線粒體外膜上。EGL-1是一種新的BH3 only蛋白，其可以通過(guò)誘導(dǎo)Drp-1從胞漿移位至線粒體進(jìn)而促進(jìn)線粒體分裂[12]。同時(shí)，也有研究表明Bax和Bak的高表達(dá)能通過(guò)誘導(dǎo)Drp-1依賴的線粒體分裂促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)Drp-1特異性抑制劑Mdivi-1能減弱ABT737誘導(dǎo)的線粒體分裂和Drp-1線粒體轉(zhuǎn)位，這表明了ABT199能誘導(dǎo)A431細(xì)胞發(fā)生Drp-1依賴的線粒體分裂。

在真核細(xì)胞內(nèi)，線粒體分裂有利于線粒體膜電位下降、線粒體外膜通透性形成和促凋亡因子的釋放（如Cyto C）。線粒體分裂是位于線粒體途徑凋亡上游的一個(gè)重要生物學(xué)事件。線粒體可以通過(guò)調(diào)控caspase激活劑（如Cyto C）的釋放參與細(xì)胞凋亡過(guò)程，與此同時(shí)，線粒體發(fā)生分裂并形成顆粒狀和點(diǎn)狀散的線粒體。但是，目前尚不清楚線粒體分裂是線粒體途徑凋亡的原因還是結(jié)果，亦或只是一個(gè)伴隨現(xiàn)象。通過(guò)時(shí)間間隔顯微鏡，研究人員證明了Cyto C的釋放要比分裂早10 min發(fā)生，這提示了分裂可能是Cyto C釋放的一個(gè)結(jié)果[13]。但也有研究指出Drp-1介導(dǎo)的線粒體分裂可以導(dǎo)致線粒體膜電位下降和Cyto C的釋放[14]。Chae等[15]證實(shí)了Drp1K38A（Drp-1顯性失活突變體）能抑制硫代硫酸銀誘導(dǎo)的Cyto C釋放和凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Mdivi-1能減弱ABT199誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降、Cyto C的釋放及caspase-3和caspase-9的活化。這提示了ABT199通過(guò)誘導(dǎo)Drp-1依賴的線粒體分裂導(dǎo)致了線粒體途徑的凋亡。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ABT199能以劑量依賴性的方式抑制A431細(xì)胞活力并誘導(dǎo)其凋亡。ABT199通過(guò)誘導(dǎo)Drp-1的線粒體轉(zhuǎn)位促進(jìn)線粒體分裂，進(jìn)而誘導(dǎo)線粒體膜電位下降，最終導(dǎo)致了線粒體途徑的凋亡。