167份西瓜種質材料的遺傳多樣性分析

郭祿芹 趙世豪 朱華玉 胡建斌 孫守如 馬長生 楊路明

摘要：以來自世界各地的167份西瓜種質資源為材料，利用形態學標記和SSR標記，結合多樣性分析、聚類分析和主坐標分析等方法，對其遺傳多樣性進行了系統全面的研究。結果表明，29個表型性狀Shannon多樣性指數的變化范圍是0.54～2.03，平均值為1.50，其中質量性狀平均值為1.16，數量性狀為1.71;18個數量性狀的變異系數變化范圍為16.43%～90.73%，平均值為34.12%。不同地區西瓜種質遺傳多樣性比較結果顯示，非洲地區的種質遺傳多樣性豐富，亞洲、北美洲次之，南美洲和歐洲的遺傳多樣性相對較低。同時，利用22對SSR標記對西瓜種質進行了遺傳多樣性分析，平均每對引物擴增4.86個等位基因，平均有效等位基因數（Ne）是2.20，平均Shannon多樣性指數（I）為0.94，平均觀測雜合度（HO）為0.27，平均期望雜合度（He）為0.52，平均多態性信息含量（PIG ）為0.45。進一步分別利用表型標記和SSR標記對167份西瓜種質材料進行分類，結果顯示SSR標記的穩定性強，能夠很好的對種質材料進行分類。

關鍵詞：西瓜;遺傳多樣性;形態學標記;SSR標記

西瓜（Citrullus lauatus）是一種重要的園藝作物，也是全世界最受歡迎的水果之一。它屬于葫蘆科（Cucurbitaceae）西瓜屬（Citrullus），西瓜屬包含4個種：西瓜種[Citrullus lauatus （Thunb.） Matsum.&Nakai;）、藥西瓜種[C. Colocyuthis（L.）Schrad]、缺須西瓜種[C. Ecirrhosus Cogn.]和諾典西瓜種[C. nau-clinianus （Sond.）Hook.f]。西瓜種包括毛西瓜亞種（ssp. lauatus）、普通西瓜亞種（ssp. vulgaris）、黏籽西瓜亞種（ssp. mucososperm，us）。為了對重要的農藝性狀如品質和產量等進行遺傳改良，育種家們對西瓜進行了長期的篩選和馴化，栽培西瓜的遺傳背景較窄，且大多對病害和蟲害沒有抵抗力，嚴重限制了西瓜育種材料的改良與創新。遺傳多樣性是作物種質資源及遺傳育種研究的基礎，因此，對來自于世界不同國家和地區的西瓜種質材料進行遺傳多樣性分析、評價不同材料間的差異與親緣關系，對于解決目前栽培西瓜育種材料過于單一的遺傳瓶頸具有重要意義。

形態學標記和分子標記已廣泛應用到西瓜種質的遺傳多樣性研究中，特別是分子標記技術如RAPD、AFLP、SSR和SNP等。其中，SSR標記由于具有共顯性、多態性好和操作簡便等優點，已經逐漸成為西瓜遺傳多樣性研究的首選標記。迄今國內外已有不少學者對不同西瓜材料進行了遺傳多樣性分析。2012年尚建立等以我國西瓜種質資源中期庫1200份西瓜種質為材料，利用12個形態學性狀對其進行遺傳多樣性和相關性分析，12個性狀的多樣性指數均值為1.70，數量性狀變異系數平均值為31.8%，果實形狀和果形指數、果肉顏色和中心糖含量、果肉顏色和種子千粒重、果皮厚度和硬度4對性狀相關性極顯著。2013年紀海波調查了768份西瓜種質資源的24個表型性狀，變異系數均值為32.41%，多樣性指數均值為1.6。2015年潘存祥等對國內外783份西瓜種質資源的24個表型性狀進行了遺傳多樣性研究，結果表明，西瓜種質資源24個表型性狀的平均變異系數為31.19%，平均遺傳多樣性指數為1.68，在歐氏距離為25時聚為2類，在歐氏距離為20時聚為3類。2015年戴照義等以88份來源不同的西瓜種質資源為材料，利用37個表型性狀和22對SSR分子標記進行遺傳多樣性分析，研究結果表明，表型性狀的變異主要體現在果實形狀和品質等性狀上。依據表型性狀進行聚類分析，在歐氏距離15.0時，供試材料聚為2類，在歐氏距離13.5時，供試材料聚為3類;22對SSR分子標記共擴增出55個多態性位點，平均多態性信息含量為0.41，利用UPGMA法進行聚類分析，可將88份西瓜種質聚為4類。2016年，石磊利用39個表型性狀和31對SSR標記對50份籽用西瓜種質資源進行遺傳多樣性和親緣關系分析，結果表明，39個表型性狀的變異系數平均值為32.24%，其中39個表型性狀的Shannon多樣性指數平均值為5.47，聚類分析中，野生型和普通西瓜各聚為一類，籽瓜種質聚為一類?；赟SR標記的聚類分析中，種質之間相似系數變化范圍為0.57～0.91，在相似系數為0.657處，50份籽用西瓜種質可分為6組。基于SSR標記的主坐標分析結果表明，50份籽用西瓜劃分為4組。

筆者利用29個形態學性狀和平均分布在11條染色體上的22對SSR標記對來源于世界各地的167份西瓜種質進行遺傳多樣性分析，旨在了解西瓜種質資源多樣性的分布情況和各種質間的親緣關系，為西瓜種質資源的遺傳改良和種質創新奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為167份西瓜種質資源，其中161份由美國農業部（USDA-ARS）提供，另有6份由瓜類種質遺傳改良與分子育種課題組收集的西瓜材料。這167份材料來源于世界各地，其中來源于美國48份，中國21份，南非13份，印度11份，加納和尼日利亞各6份，津巴布韋、印度尼西亞和蘇聯各4份，蘇丹、土耳其、日本等6個國家各3份，烏茲別克斯坦、索馬里等7個國家各2份，埃及、智利、加拿大等18個國家各1份。

1.2 材料種植與表型調查

材料于2016年3月26日種植在鄭州市毛莊綠園蔬菜生產基地日光溫室中，采用隨機區組方式種植，5次重復，每壟2行，行距1.6m，每行定植18株，株距0.5m，開花期進行人工授粉，常規管理。在西瓜生長不同時期，參照《西瓜種質資源描述規范和數據標準》對29個表型性狀進行調查記錄。

1.3 DNA提取與分子標記分析

在幼苗期采集幼嫩葉片，采用改良 CTAB法提取西瓜供試樣品DNA。筆者從Zhu等西瓜全基因組開發的SSR引物中選取了22對引物進行基因型分析，PCR反應體系為10μL，其中DNA 25ng，SSR引物0.5μmol·L^-1，dNTP 0.2 mol·L^-1，和0.5UTaq酶，1×PCR buffer， PCR產物采用聚丙稀酰胺凝膠電泳，利用銀染法顯色，并拍照保存。

1.4 數據分析

11個西瓜質量性狀按照表1進行賦值，并統計各性狀的頻率分布及其多樣性指數。采用Excel2010統計各性狀數據，并計算各數量性狀的最大值、最小值、平均值、極差和變異系數。各性狀的遺傳多樣性采用Shannons信息指數（1）進行評價，I=-∑（Pi）（lnPi）， Pi表示第i種變異類型出現的頻率。采用SPSS 22軟件對各性狀進行方差分析。采用MEGA 6.0軟件對167份西瓜種質進行聚類分析。使用NTSYS-pc 2.1軟件對167份西瓜種質進行主坐標分析。

根據PCR擴增結果選擇重復性好、譜帶清晰的SSR標記記錄結果。在相同遷移位置上，有條帶記為1，無條帶記為0。利用GeneAlEx 6.4計算觀察等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Shannons信息指數（I）、觀察雜合度（Ho）和期望雜合度（He）。多態信息含量PIC=1一∑Pi²。采用Structure 2.3.4軟件，對167份西瓜種質的基因型數據進行基于Bayesian算法的群體結構檢測，以確定試驗群體的數目。通過分析后驗概率lnP（ D）值的方差以及變化速率，發現模型的lnP（ D）隨著K值的增大持續增加，難以確定真實的K值，因此參照Evanno等的方法通過OK來確定K值。

2 結果與分析

2.1 表型性狀遺傳多樣性分析

2.1.1 質量性狀遺傳多樣性分析西瓜的11個質量性狀按照表1進行賦值并進行統計分析，結果見表2。它們的多樣性指數變幅是0.54～1.81，平均值為1.16，其中6個性狀（果皮底色、覆紋顏色、覆紋形狀、果肉顏色、種子顏色、種子覆紋特征）的多樣性指數大于1。多樣性指數最高的是種子顏色，主要以黃色、紅褐色、黑色為主。果實形狀大部分為圓形（74.22%），個別（2.13%）是一些畸形的形狀。果皮底色主要以淺綠色（32.40%）和綠色（30.80%）為主，白色（0.60%）和黃色（0.60%）屬于稀有性狀。果肉顏色主要是紅色（29.30%）和粉紅色（22.30%），也有部分黃色（14.10%）和綠色（4.70%）。大部分種質果實有覆紋（83.70%），其覆紋顏色主要以綠色（28.30%）為主，覆紋形狀以條帶（30.80%）和網紋（26.20%）為主。大部分種質果實表面光滑（84.00%），個別有溝（12.00%）、棱（3.70%）和瘤（0.20%）。大部分種質果實表面有果粉（70.00%）。大部分種子形狀為卵圓（75.88%）;大部分種子沒有覆紋（57.38%），有覆紋的種子以黃褐色斑塊（14.76%）和黑色斑塊（13.10%）為主。

2.1.2 數量性狀遺傳多樣性分析對18個數量性狀的分析顯示其多樣性指數變幅為1.36～2.03表3），平均值為1.71，數量性狀的多樣性指數普遍高于質量性狀的多樣性指數，說明西瓜種質數量性狀的變異范圍更大。7個數量性狀的變異系數超過30%，變異系數最大的是邊糖含量（90.73%），中心糖含量次之（88.52%），然后依次為果柄長度（58.68%）、果實質量（49.84%）、果皮厚度（36.54%）、種子厚度（35.92%）和種子寬度（34.63%）。其余11個數量性狀的變異系數相對較小（16.43%～26.08%，見表3），表明它們在不同的西瓜種質之間變異較小。F測驗結果顯示，除果皮厚度和種子長度外，其他性狀在167個材料之間都具有顯著差異，表明不同西瓜種質資源具有明顯的表型差異。

2.1.3 不同地區種質資源遺傳多樣性分析167份種質材料的來源可分為5個生態區域，即北美洲、南美洲、歐洲、亞洲和非洲。筆者研究了與果實相關的13個性狀在不同生態區的多樣性指數差異（表4）。其中，非洲西瓜種質的表型性狀多樣性明顯豐富（2.216），除了果皮顏色，其他12個性狀的多樣性指數均高于所有種質相對應的平均值。其次是亞洲（1.785），果肉厚度（3.972）和果皮底色（4.505）多樣性指數均為高于其他地區，其他性狀的多樣性指數都在平均值附近波動。北美生態區除了果肉厚度、果皮底色2個性狀外，其他11個性狀的多樣性指數均高于平均值，北美種質果實形狀（0.777）和覆紋形狀（1.733）的多樣性指數比其他地區都高。而種質較少的南美洲，除了果實形狀（0.500），其他性狀均低于相應性狀的多樣性指數平均值。歐洲種質除了覆紋顏色（1.557）和果肉顏色（1.418）的多樣性指數高于平均值，其他11個性狀的多樣性指數均低于相應性狀的平均值，且果實形狀的多樣性指數為0。北美洲、非洲、亞洲、南美洲和歐洲5個生態區種質的平均多樣性指數分別為1.725.2.216.1.785、1.146、1.181。所有西瓜種質13個形態性狀的平均多樣性指數為1.611。由此可見，在西瓜種質中，非洲地區的種質表型多樣性最為豐富，亞洲、北美洲次之，南美洲和歐洲的表型多樣性相對簡單。

2.1.4 基于表型性狀的聚類分析根據29個表型性狀，利用UPGMA法對167份種質進行聚類分析（見圖版A，彩色插頁第12頁）。在聚類圖中，材料165單獨位于聚類圖的最外層，說明與其他材料的親緣關系較遠。除165外，其他西瓜種質材料可分為4組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）。I組共有38份種質，主要來源于北美洲（15）和亞洲（14）;II組共有5份種質，主要來源于非洲（3）;Ⅲ組共有60份種質，主要來源于亞洲（16）和非洲（23）;N組共63份種質，主要來源于亞洲（26）和北美洲（21）。從聚類圖可以看出，除了來源于亞洲和非洲的種質相對集中外，不同來源的種質相互交織在一起，并沒有按照來源區分開，說明同一類群間種質材料的遺傳背景相似度的高低和親緣關系的遠近與來源地無顯著相關性，也可能是由于表型數據易受環境影響而造成的誤差所導致。

2.1.5 基于表型性狀的主坐標分析 對167份西瓜種質的29個性狀的統計數據進行標準化處理，采用NTSYS-pc 2.1軟件進行主坐標分析（PCoA）（圖1）。前3個特征向量解釋了34.57%的總變異，第一和第二特征向量分別解釋了16.24%和10.04%的變異。所有西瓜種質可根據其PCoA圖分為4個區域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），I區69份材料，其中44份來自亞洲，此區種質分布相對集中，說明其種質遺傳變異狹窄。Ⅱ區47份材料，其中25份來自非洲，此區種質分布也較集中，但較I區分散，說明其遺傳多樣性高于Ⅰ區。Ⅲ區33份材料，其中25分來自北美洲，此區種質分布相對分散，說明其遺傳變異較豐富。Ⅳ區18份材料，其中5份來自非洲，6份來自亞洲，5份來自北美洲。與聚類結果相似，除來源于亞洲和非洲的種質相對集中外，其他不同來源的種質沒有明顯區別，再次說明不同來源的種質之間沒有明顯的差異。

2.2 SSR標記遺傳多樣性分析

2.2.1 SSR位點遺傳多樣性分析從480對引物中篩選出22對多態性引物，在167份材料中共獲得107個多態性位點（表5），平均每個引物擴增出4.86個多態性位點，引物的等位基因數變化范圍為2～8個。等位基因數最多的標記是WMSSR24630和WMSSR26564，均檢測到8個。引物的平均有效等位基因數（Ne）的范圍為1.37～4.24，平均2.20;各引物的Shannon指數（1）的變化范圍是0.54～1.61，平均值為0.94;觀測雜合度（Ho）的范圍為0.02～0.99，平均值為0.27;期望雜合度（He）平均值為0.52，幅度為0.27～0.770多態性信息含量（PIC）范圍為0.25～0.73，平均值為0.45。以上數據表明，22對引物在西瓜種質中具有較好的多態性，SSR檢測位點上具有豐富的遺傳多樣性。

2.2.2 基于SSR位點的Structure分析依據Struc～ture運算結果可將167份西瓜種質劃分為4個類群，命名為P1、P2、P3和P4（見圖版B，彩色插頁第12頁）。P1類群含有73份種質（43.71%），主要來源于亞洲（28）和北美洲（26）;P2類群包含64份種質（38.32%），同樣主要來源于亞洲（32）和北美洲（20）：P3類群包含17份種質（10.18%），主要來源于非洲（14）;P4類群含有13份種質（7.78%）主要來源于非洲（10）和北美洲（3）。對所有材料的Q值進行分析，發現供試材料中，127份（76.05%）材料的Q值大于0.80，表明其親緣組成相對單一，40份材料的Q值介于0.492和0.800之間，具有雜合親緣。

2.2.3 基于SSR位點的聚類分析根據分子標記結果，利用DPS 7.05軟件計算各種質間的遺傳相似系數，采用UPGMA聚類方法繪制進化樹（見圖版C，彩色插頁第12頁），可將167份西瓜種質分為3個類群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），整體來說所選西瓜種質材料具有豐富的遺傳多樣性。其中，第Ⅰ類群只有2份種質（編號89、90）;第Ⅱ類群共15份種質，全部來源于非洲;第Ⅰ類群和第Ⅱ類群與Structure結果的P3完全一致。第Ⅲ類群共150份種質，對應Structure結果的P1、P2、P4，綜上所述，基于UPGMA的聚類結果與 Structure結果基本一致。

2.2.4 基于SSR位點的主坐標分析從主坐標圖上可以看出（圖2），所有材料明顯可以分為2大類群。第Ⅰ類群包括150個材料，對應Structure的P1、P2、P4以及UPGMA的第Ⅲ類群;第Ⅱ類群包括17個材料，對應Structure結果的P3和UPGMA的第Ⅰ和第Ⅱ類群。結果表明，167份種質的主坐標分析結果與Structure結果和UPGMA聚類結果高度致。

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討論

3.1 西瓜形態學標記的遺傳多樣性

形態學標記是基于個體外部特征、生理性狀及生態地理分布等特征為遺傳標記的性狀描述，得到的結論往往不夠完善，且易受環境的影響，但形態標記比分子標記更直觀更容易獲得。其中變異系數和多樣性是兩個反映生物體形態遺傳多樣性的重要遺傳參數。潘存祥等對國內外783份西瓜種質資源24個表型性狀進行了遺傳研究，發現24個表型性狀多樣性指數平均值為1.68，平均變異系數為 31.19%，其中種子覆紋顏色變異系數最大（70.90%），第一雌花節位變異系數最?。?.48%）。紀海波對768份西瓜種質資源的13個數量性狀和11個質量性狀進行研究，其平均多樣性指數為1.6，變異系數均值為32.41%，其中種子斑紋形狀的變異系數最大（73.32%），開放雌花到莖生長點距離的變異系數最?。?.32%）。前者研究的多樣性指數均介于本實驗的質量性狀（1.16）和數量性狀（1.71）之間，而本研究中變異系數的變幅范圍為16.43%～90.73%，均高于前者的研究。劉子記等以82份小型西瓜核心種質為研究材料，對6個果實性狀進行遺傳多樣性分析，6個果實性狀的多樣性指數變化范圍在4.29～4.39。石磊分析了來自我國不同區域及國外品種共計50份籽瓜種質樣品，39個表型性狀的平均變異系數為32.24%，變異系數的范圍為6.88%～75.88%，表型性狀的多樣性平均為5.47，其變幅為2.58～5.64，多樣性指數均高于先前的研究。不同的研究結果表明西瓜的表型遺傳多樣性可能跟試驗群體、試驗材料來源及表型性狀的數量等因素有關。本研究將不同生態區域的多樣性進行了比較分析，發現來源于非洲地區的西瓜種質在形態性狀，如果實質量、果實縱橫徑及中心糖含量上差異較大（2.216），說明非洲地區的西瓜種質資源遺傳多樣性比較豐富，也進一步驗證了非洲是西瓜的發源地。來源于亞洲、北美洲、南美洲和歐洲的西瓜種質遺傳多樣性相對簡單，說明了西瓜的遺傳基礎狹窄，在長期的人工選擇和馴化過程中不同材料之間的變異越來越小。

3.2 西瓜SSR標記的遺傳多樣性

SSR標記是從分子水平揭示西瓜種質資源間的差異，通過選擇合適的標記，能夠很好地揭示西瓜種質資源的遺傳多樣性。張法惺等采用38對SSR標記對%份不同生態型西瓜種質進行遺傳多樣性分析，共擴增出826個多態性條帶，平均每對引物21.74個。聚類結果表明野生西瓜與栽培西瓜的親緣關系較遠，聚類結果與本研究相似。趙勝杰等利用22對SSR標記構建了27份中國無籽西瓜主栽品種的DNA指紋圖譜并進行了遺傳多樣性分析。22對多態性引物共擴增出58種基因型，基因數2～5個，平均2.64個。本研究采用22對SSR引物對167份西瓜種質材料進行分析，擴增出107個多態性條帶，平均每個引物擴增出4.86個多態性位點，低于張法惺的21.74個，高于趙勝杰的2.64個，這可能與SSR引物自身的多態性和引物篩選標準不同有關。李朋飛等利用SRAP分子標記對80份西瓜種質資源進行遺傳多樣性分析時，發現來源不同的西瓜材料被劃分到一個類群，本研究中表型數據和分子數據的UPGMA聚類結果都表現出這一現象，說明聚為一類的西瓜種質的遺傳相似度較高，可能跟西瓜的遺傳背景比較狹窄和表型數據易受環境影響有關，因此，西瓜在育種上要加強種質資源的引進與創新。

3.3 2種標記研究遺傳多樣性的比較

在本研究中，表型標記和SSR標記在167個西瓜種質資源中均表現出良好的多態性，但聚類結果、PcoA結果和Structure結果均不能按照其來源將西瓜群體明顯的劃分類群。形態學標記的聚類分析與SSR標記的聚類分析結果不一致的現象在之前研究中也有體現。造成這種現象的原因可能是所用的材料沒有包括西瓜屬的所有類型，表型本身受環境影響較大，或者引種等原因造成的同物異名。因此，在表型調查中通過設置小區重復和多年重復來減少人為和環境因素造成的誤差。也可通過加密西瓜染色體上SSR標記更加精確地反映出不同材料間的遺傳差異。最后，運用關聯分析方法從表型和分子水平進行全面分析，進而得到科學可靠的結果，更準確的評價西瓜種質資源的遺傳多樣性。