三種激素性股骨頭壞死造模影像病理學比較研究*

李興國，趙道洲，張 磊

甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050

激素性股骨頭壞死是臨床常見的致殘率較高的骨科疾患。隨著激素類藥物在臨床、食物中的廣泛應用，激素性股骨頭壞死的相關報道屢見不鮮，且發病年齡趨于年輕化。激素性股骨頭壞死來院就診時大多已經出現股骨頭及髖關節變形，不得不進行人工關節置換［1］。當前，激素性股骨頭壞死的防治已成為世界性的醫學課題。早診斷，積極保頭的治療可免于或者延遲人工髖關節置換術［2-3］。因此，國內外學者用不同的方法建立SANFH模型，進而從分子、基因等方面對發病機制進行了深入研究［4］。本研究復習文獻選擇常用且不同的3種造模方法：單純激素法、內毒素加激素法和馬血清加激素法，建立不同的激素性股骨頭壞死模型，從影像學、組織病理學方面進行研究，比較出典型的、接近臨床的兔激素性股骨頭壞死模型，并進一步研究激素性股骨頭壞死的發病病因及發病機理。

1 材料與方法

1.1 動物 同齡、健康新西蘭大白兔48只，雌雄各半。新西蘭大白兔來自中國農業科學院蘭州獸醫研究所，實驗動物許可證號：SCXK(甘)2010-0001。

1.2 主要試劑及儀器 大腸桿菌內毒素(LPS，美國Sigma公司生產，國藥準字S10820320，規格：25 mg/瓶)；甲基強的松龍(MP，上海羅氏公司，批號：H20030727，規格：500 mg/ 瓶)；地塞米松磷酸鈉注射液(DXM，天津藥業焦作有限公司，國藥準字H41020036，規格：10 mL/支)；馬血清(上海卓康生物科技有限公司，國藥準字S10910131，規格：200mL/瓶)；慶大霉素［天津藥業焦作有限公司，國藥準字H41020089，規格：20 mL(80萬 U)/支］；戊巴比妥鈉(上海試劑二廠，批號：810923)。實驗室為蘭州軍區蘭州總醫院骨科研究所實驗室。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組及飼養 48只同齡健康新西蘭大白兔于蘭州軍區動物飼養科飼養。動物適應性喂養1周后稱重，以體質量按隨機數字表法隨機分為 4組：A組(空白組)、B組(單純激素組)、C組(內毒素加激素組)、D組(馬血清加激素組)。各組雌雄不限，體質量2.2～3.0 kg，均在同一條件下室內單籠飼養，進食普通飼料，溫度(20±2)℃，濕度50%。實驗過程中動物處置符合2006年科學技術部發布的關于善待實驗動物的指導性意見［5］。

1.3.2 造模 A組(空白組)與其他組同時間點注射等量生理鹽水；B組(單純激素組)同時間點兔雙側臀肌注射地塞米松(DXM)2.5 mg/(kg·d)，連續注射9周；C組(內毒素加激素組)第1天于兔耳緣靜脈注射大腸桿菌內毒素(LPS)20 μg/kg，間隔24小時再次注射LPS，在第2次注射完大腸桿菌內毒素后隨即肌肉注射甲基強的松龍20 mg/(kg·d)，共3次，間隔24小時。每次注射前均重新稱重后計算劑量。D組(馬血清加激素組)兔耳緣靜脈注入馬血清共10 mL/(kg·次)，共2次，間隔2周。第2次馬血清注射后2周，再連續3天臀部注射甲基強的松龍 40 mg/(kg·d)［6］。所有動物臀部肌注慶大霉素每天8萬U，連續1周，以預防感染。

1.4 觀察指標

1.4.1 一般行為學 一般形為學觀察包括動物活動度、體質量、尿量、精神、毛發光澤度等。后期病理切片取材時觀察股骨頭外觀。

1.4.2 X線檢查 D組兔最后1次注射完甲基強的松龍次日計為所有動物實驗開始第1日。第3、6、9周各組兔子以3%戊巴比妥鈉12 mg/kg耳緣靜脈注射麻醉后拍攝X線片，主要觀察兔股骨頭X線平片變化情況，對X線平片進行定性評價：包括股骨頭形態、密度、骨小梁結構及骨皮質連續性等。

1.4.3 組織病理學 將第3、6、9周各組隨機抓取的2只兔子以空氣栓塞法處死后，手術取出雙側股骨頭，由基底部沿正中冠狀面將股骨頭劈開，立即4%多聚甲醛液固定48小時，10%乙胺四乙酸二鈉(EDTA)脫鈣1～2周，流動水沖洗24小時，系列酒精脫水，常規石蠟包埋，4 μm層厚切片，行HE染色。光鏡下觀察骨小梁、骨細胞、髓腔脂肪細胞。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件分析數據，計量資料以(±s)表示，采用單因素方差分析，各組間效應差異應用重復測量方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般行為學 A組：正常飲食，體質量漸增。B、C、D組動物注射藥物后出現精神萎靡，活動及飲食飲水次數減少，反應淡漠，并出現畏寒喜蜷縮，雙耳下垂，部分動物流涕，部分出現腹瀉，動物于末次注射后3周明顯消瘦，體質量減輕。A組動物于末次注射后4周體質量增加，注射中有1只動物死亡。B組注射中有3只動物死亡；C組末次注射后10天內有5只動物死亡，D組末次注射后10天內有4只動物死亡。實際進入統計的實驗動物為A組11只，B組9只，C組7只，D組8只。4組新西蘭大白兔造模前及造模后體質量比較結果見表1。

表1 各組動物實驗前后體質量比較(±s) kg

表1 各組動物實驗前后體質量比較(±s) kg

注：△表示與空白組比較，P＜0.01；▲表示與單純激素組比較，P＜0.05

組別 只數 實驗前 實驗后空白組(A) 11 2.24±0.83 2.55±0.81單純激素組(B) 9 2.26±0.94 1.82±0.74△內毒素加激素組(C) 7 2.23±0.68 1.81±1.01△▲馬血清加激素組(D) 8 2.27±0.89 1.79±0.91△▲

由表1可見，1)實驗前各組間兔體質量比較差異無統計學意義(P＞0.05)，說明分組時遵守組間均衡一致的原則；2)實驗結束時，空白組兔體質量明顯增加，與其他3組比較差異有統計學意義(P＜0.01)，證明激素對兔體質量有較大影響；3)C、D組與B組比較，結果表明：內毒素和馬血清組對兔體質量影響與單純激素組比較差異有統計學意義(P＜0.05)；4)C、D 2組間比較毒素和馬血清對兔體質量影響差異無統計學意義(P＞0.05)。2.2 X線檢查 各組兔子于第3、6、9周以3%戊巴比妥鈉12 mg/kg耳緣靜脈注射麻醉后拍攝X線片。A組：雙側髖關節間隙正常，無關節面塌陷等情況，骨小梁清晰可見，骨質正常，無骨質疏松等異常表現(見圖1)。B組：第9周時關節間隙稍狹窄，骨質輕度疏松(見圖2)。C組：第6周時關節間隙稍狹窄，骨質疏松明顯(見圖3)；第9周時關節間隙明顯變窄，骨質疏松加重，并伴有輕度骨小梁模糊不清(見圖4)。D組：第6周時關節間隙狹窄，骨質疏松明顯，并伴有輕度骨小梁模糊不清(見圖5)。第9周時關節間隙狹窄更加明顯，骨質疏松加重，可見股骨頭模糊不清(見圖6)。

圖1 A組第9周時的正常X線片

圖2 B組第9周時X線片

圖3 C組第6周時X線片

圖4 C組第9周時X線片

圖5 D組第6周時X線片

圖6 D組第9周時X線片

2.3 病理學檢查結果 第3、6、9周時手術取出各組動物股骨，于股骨頭基底部將股骨頭分離，沿正中冠狀面將股骨頭劈開，立即4%多聚甲醛液固定48小時，10%EDTA脫鈣1～2周，系列酒精脫水，常規石蠟包埋，4 μm層厚切片，行蘇木精-伊紅染色(HE)染色。光鏡下觀察骨小梁、骨細胞、髓腔脂肪細胞的變化。A組：股骨頭軟骨厚度均勻一致，軟骨細胞排列整齊；骨小梁結構完整、粗壯，排列規則整齊，致密飽滿，骨陷窩內骨細胞形態正常，骨細胞清晰可見，核較大、位于中央，骨髓腔增生活躍，造血細胞豐富，骨髓腔內脂肪細胞形態正常(圖7)。B組：第3、6周所取標本同A組，第9周股骨頭形態基本正常股骨頭軟骨稍薄(圖8)。C組：第3周取材切片同A組。在第6、9周于股骨頭干垢端即股骨頭與股骨頸交界的應力區可見部分骨小梁斷裂，有軟骨破壞，無股骨頭表面塌陷等情況，第9周脂肪變性加重及壞死骨組織擴大(圖9)。D組：第3周取材同A組。在第6、9周見股骨頭形態完整，股骨頭軟骨面有輕度毛糙，稍欠光滑，略呈灰白色。無軟骨缺損及股骨頭表面塌陷等情況(圖10)。

圖7 A組病理學檢查結果(HE×40)

圖8 B組病理學檢查結果(HE×40)

圖9 C組病理學檢查結果

圖10 D組病理學檢查結果(HE×10)

3 結論

經過激素性股骨頭壞死3種模型方法的比較分析發現，內毒素加激素組和馬血清加激素組兩種方法均成功實現了造模。其中依據病理切片通過骨組織形態比較［7］發現以內毒素加激素組造模出現壞死征像較早，馬血清加激素組次之，單純激素未獲得成功。

從實驗周期看，馬血清加甲強龍組造模前需要注射2次馬血清，中間間隔2周，再持續注射甲基強的松龍3次，造模前準備總計17天。內毒素加甲基強的松龍組造模前準備總計7天。造模6周后內毒素加激素組56%、血清加激素組67%出現股骨頭壞死，而動物死亡率分別為42%(5/12)，33.33%(4/12)。Matsui等［8］模型中未提及動物死亡率，Kabata等［9］模型中動物死亡率為40%(8/20)。不考慮該實驗動物的種群膽小怕驚嚇致死等個體差異因素［10］，動物死亡率偏高，與其他報道一致。實驗兔子來源廣泛，易于飼養和管理，兔子壽命相對較長可做長期藥理藥物實驗，重復性高。

如何增加兔模型下肢負重［11］，或者增加兔髖關節機械壓力，加速造模，提高造模成功率，為后期實驗研究提供保障。股骨頭壞死的生物力學影響因素越來越受到人們的重視。因此基于動物模型，結合激素模仿人體生物力學的研究顯得十分必要。在今后研究中可嘗試運用小劑量低頻率，大劑量低頻率等方法以降低成本，節省資金和人力資源。

本研究發現第3、6周均見股骨頭形態光滑完整，股骨頭表面軟骨乳白色，無軟骨缺損及股骨頭表面塌陷等，情況同空白組。第9周股骨頭形態基本光滑完整，股骨頭軟骨面色澤稍暗。股骨頭病理切片檢測示：第3、6周所取標本同空白組。第9周股骨頭形態基本正常，股骨頭軟骨稍薄。在DR拍片檢查中第3、6周同空白組，第9周時關節間隙稍有狹窄，骨質輕度疏松。單純激素組未能誘導出激素性股骨頭壞死模型，部分學者認為采用其他方法聯合造?？赡芘c單純激素造模在調節因子和酶類的蛋白表達等機制方面有所不同，有待進一步研究。

本研究中馬血清加甲強龍組、內毒素加甲強龍組在第9周不論是股骨頭大體標本觀測還是股骨頭病理切片檢測以及DR拍片檢查均符合激素性股骨頭壞死的診斷標準。同時顯示內毒素加激素組在血液系統檢查、病理切片檢查方面早于馬血清加激素組，但部分指標2組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。內毒素加激素組和馬血清加激素組均在6到9周出現了不同程度的股骨頭壞死征象，證明2組造模可靠，可為藥物試驗提供良好的平臺。