MDBK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)馴化方法及懸浮細(xì)胞系的建立

一、材料與方法

1.材料。MDBK細(xì)胞，金宇保靈獸用疫苗國家工程實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM培養(yǎng)基、胰酶、低血清培養(yǎng)基，均購自賽默飛世爾科技有限公司。無血清懸浮培養(yǎng)基購自上海奧浦邁生物科技有限公司。

2.方法。

（1）低血清培養(yǎng)馴化：取正常生長的貼壁MDBK細(xì)胞，在培養(yǎng)基中添加部分低血清培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞適應(yīng)生長后逐漸加大低血清培養(yǎng)基添加量，直至全部更換為低血清培養(yǎng)。待細(xì)胞完全適應(yīng)低血清培養(yǎng)后冷凍保存，備用；

（2）低血清懸浮培養(yǎng)馴化：取已適應(yīng)低血清培養(yǎng)的貼壁MDBK細(xì)胞，用胰酶消化后，按照5×105cells/ml加入三角搖瓶中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：37℃，110 rpm，5%二氧化碳。待細(xì)胞適應(yīng)懸浮培養(yǎng)后，冷凍保存，備用；

（3）無血清懸浮培養(yǎng)馴化：取已適應(yīng)低血清懸浮培養(yǎng)的MDBK懸浮細(xì)胞，在低血清培養(yǎng)基中添加部分無血清培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞適應(yīng)生長后逐漸加大血清培養(yǎng)基添加量，直至全部更換為無血清培養(yǎng)。

二、結(jié)果與分析

在馴化過程中出現(xiàn)了細(xì)胞活力低、細(xì)胞死亡、生長緩慢、細(xì)胞聚團(tuán)等一系列問題，通過以下方法得以解決：

MDBK-S懸浮細(xì)胞

1.細(xì)胞活力低、死亡問題，通過持續(xù)添加待馴化細(xì)胞提高細(xì)胞密度或更換部分培養(yǎng)基得以改善。

2.細(xì)胞生長緩慢問題，通過篩選適宜的培養(yǎng)基，及時(shí)補(bǔ)充葡萄糖及谷氨酰胺，調(diào)整轉(zhuǎn)速來解決。

3.細(xì)胞聚團(tuán)問，通過消化分散添加葡聚糖或細(xì)胞沉降、篩網(wǎng)過濾獲取單個(gè)細(xì)胞。通過上述方法持續(xù)改進(jìn)，最終獲得分散良好的MDBK細(xì)胞株。該懸浮細(xì)胞命名為MDBK-S，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC No.11795。細(xì)胞呈圓形，直徑14～25 μm，細(xì)胞分散均勻，可在不依賴附著物的情況下純懸浮培養(yǎng)，通過溶液優(yōu)化與篩選細(xì)胞密度可達(dá)107cells/ml以上，細(xì)胞平均倍增時(shí)間35 h左右。

三、討論

通過初步試驗(yàn)，該細(xì)胞可用于牛病毒性腹瀉/粘膜病、牛傳染性鼻氣管炎、牛呼吸道合胞體、牛副流感3型等病毒的培養(yǎng)，單位體積病毒產(chǎn)量可提高5～10倍，應(yīng)用前景廣闊。

懸浮培養(yǎng)相比貼壁培養(yǎng)的優(yōu)勢在于，可利用反應(yīng)器大量培養(yǎng)細(xì)胞，生產(chǎn)放大工藝簡單，批間差較小，勞動(dòng)強(qiáng)度小，占地空間少，生產(chǎn)效率提升明顯。

參考文獻(xiàn)（略）