HPLC法測定蒙藥哈敦嘎日迪-13丸中木香烴內酯和去氫木香內酯的含量△

安 明 薄彧坤 楊 丹 張慧敏 鄔國棟*

(1.包頭醫學院，內蒙古 包頭 014060；2.包頭醫學院2014級藥學本科，內蒙古 包頭 014060)

哈敦嘎日迪-13丸是根據蒙醫藥理論基礎和臨床經驗設計的處方，并結合現代制劑工藝制成的制劑,制劑批準文號：M14020127，又名：哈敦海魯木勒十三味丸。處方由主藥五靈脂、石菖蒲、訶子和草烏葉、木香，副藥，拳參、黑冰片、香青蘭以及白豆蔻、紅花、甘松、麥冬和牛膽粉這13味藥物組成，具有清肺熱、消粘、止痢作用，可用于治療胃腸痙攣、嘔吐、腹瀉、赤白痢疾等疾病。方中的木香主治行氣止痛、健脾消食，其主要成分為木香烴內酯和去氫木香內酯, 本試驗參考中國藥典、內蒙古蒙藥制劑規范中木香測定方法，建立高效液相色譜法同時測定木香烴內酯和去氫木香內酯，可作為哈敦嘎日迪-13丸的質量控制方法。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(Ultimate 3000系列)、SartoriusBSAS-CW電子天平、AS2060B超聲波清洗器、Thermo制純水儀、過濾裝置、AP系列無油隔膜真空泵。

1.2 試劑 色譜純試劑(甲醇、乙腈)；分析純試劑(無水乙醇、三乙胺、磷酸、乙酸乙酯、甲酸、三氯甲烷)；水為高純化水；三氯化鐵(天津市盛奧化學試劑有限公司)；薄層層析硅膠G(青島海洋化工有限公司)。

1.3 試藥 木香烴內酯對照品(批號111524-201710，含量以99.5%計)去氫木香內酯(批號111525-201711，含量以99.8%計)購自于中國食品藥品檢定研究院。

哈敦嘎日迪-13丸供試品3批(生產批號：710202、201801、201802)，由包頭市蒙醫中醫醫院提供；實驗室自制模擬小樣一批。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，本實驗研究采用的色譜柱為SHIMADZU C18色譜柱(4.6mm×150mm，5μm)；流動相為甲醇-水(65：35)；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：225nm；進樣量10μL。從多批檢測數據可見，木香烴內酯和去氫木香內酯的理論塔板數在5000以上即可達到較好的分離效果，考慮到不同顏色的色譜柱具有不同的理論塔板數，故確定理論塔板數按木香烴內酯和去氫木香內酯峰計算應不低于5000[1]。

2.2 對照品溶液的制備 取木香烴內酯對照品0.02266g，置于50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成含木香烴內酯0.4509 mg·mL-1的對照品溶液，見圖1。同樣，取去氫木香內酯對照品0.03813g，置于50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成含去氫木香內酯0.3805mg·mL-1的對照品溶液，見圖2。

2.3 供試品溶液的制備 取同一批號樣品(批號710202)6份，約3.82g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，放置過夜，稱定重量，超聲處理30min,放冷，再稱定重量，用25%的甲醇補足減少的重量，搖勻，濾過，取續濾液，作為樣品溶液，用微孔濾膜濾過，即得，見圖4。

2.4 模擬樣溶液的制備 分別稱取哈敦嘎日迪-13所需藥材，按照處方比例要求混合，磨成粉末，精密稱取約3.82g,置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，放置過夜，稱定重量，超聲處理30min,放冷，再稱定重量，用甲醇補足減少的重量，搖勻，濾過，取續濾液，作為樣品溶液，用微孔濾膜濾過，即得，見圖5。

2.5 陰性對照溶液的制備分別稱取除木香外的其它藥材，按照哈敦嘎日迪-13處方比例要求混合，研磨成粉，按照“2.3”項下供試品溶液的制備方法制備陰性對照品溶液，見圖6。

2.6 專屬性試驗 分別精密量取對照品溶液、對照藥材溶液、供試品溶液、模擬樣溶液和陰性對照品溶液各10μL,注入高效液相色譜儀，按照“2.1”項下色譜條件下，記錄色譜圖，結果見圖6。結果表明，在本色譜條件下供試品溶液以及模擬樣溶液中木香烴內酯和去氫木香內酯與藥品中的其他成分分離度好，在相同保留時間內都有對應的色譜峰，而在此保留時間內陰性對照品溶液并沒有干擾，故可知本次試驗方法的專屬性良好。

2.7 線性關系考察 取482.2μm/mL木香烴內酯及423.152μg·mL-1對照品溶液5mL加入到20mL容量瓶中，精密加入甲醇制成含107.4μg·mL-1木香烴內酯及105.788μg·mL-1去氫木香內酯的混合對照品溶液；分別精密吸取2μL、4μL、6μL、8μL，10μL、12μL、及6μL、8μL、10μL、12μL、14μL、16μL注入高效液相色譜儀中[2]。以峰面積對濃度進行回歸分析，木香烴內酯的回歸方程：y=6.8165x+0.0487,r=0.99998；去氫木香內酯的回歸方程：y=5.0662x-0.0805,r=0.99995；結果顯示：木香烴內酯在0.2148μg·mL-1～1.20288μg·mL-1的質量濃度范圍內相應峰面積呈良好的線性關系，去氫木香內酯在0.634728μg·mL-1～1.692608μg·mL-1，標準曲線結果見圖7、圖8，數據見表1、表2。

表1 木香烴內酯的標準曲線數據表

濃度C(μg·mL-1)0.21480.42960.64440.85921.07401.20288平均峰面積A6.862213.679320.522127.337534.038640.9882

由表中數據可知：木香烴內酯在0.2148～1.202888μg·mL-1的質量濃度范圍內與相應的峰面積呈現良好的線性關系。

表2 去氫木香內酯的標準曲線數據表

由表中數據可知：去氫木香內酯在0.6347～1.6926μg·mL-1的質量濃度范圍內與相應的峰面積呈現良好的線性關系。

2.8 精密度試驗 取“2.2”項下的木香烴內酯和去氫木香內酯對照品溶液10μL,按照“2.2.1.1”項下的色譜條件連續重復進樣6針，木香烴內酯峰面積的平均值為124.4337，RSD為0.12%(n=6)，去氫木香內酯峰面積的平均值為83.0762，RSD為0.41%(n=6)說明其精密度良好。

2.9 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0h,2h,4h,8h,12h注入高效液相色譜儀10μL按照“2. 1”項下的色譜條件進行測定，數據見表3、表4。

表3 不同時間測定樣品中木香烴內酯的峰面積積分值

表4 不同時間測定樣品中去氫木香內酯的峰面積積分值

由表中數據可知，供試品溶液中的木香烴內酯及去氫木香內酯在12h之內穩定，穩定性良好

2.10 重復性試驗 取同一批號樣品(批號710202)6份，約3.82g，精密稱定，按照“2.3供試品溶液的配制”項下的方法平行制備6份供試品溶液，并且按照“2.1”項下的色譜條件測定木香烴內酯和去氫木香內酯的峰面積。計算可得各份樣品中木香烴內酯和去氫木香內酯的含量，結果表明，哈敦嘎日迪-13丸中木香烴內酯及去氫木香內酯的重復性較好,見表5、表6、圖9。

表5 木香烴內酯重復性測定結果

表6 去氫木香內酯重復性測定結果

2.11 加樣回收率試驗 精密稱定樣品(批號710202)9份，每份約1.91g，分為3組，分別置于9個具塞錐形瓶中，再分別在3組具塞錐形瓶中精密加入木香烴內酯對照品溶液(濃度0.4509 mg·mL-1)2mL，4mL,6mL。(約相當于供試品含有量的50%，100%，150%)再加入去氫木香內酯(濃度0.3805mg/mL)4mL，8mL，12mL，(約相當于供試品含有量的50%，100%，150%)再加入甲醇44mL，38mL，32mL。分別注入上述溶液各10μL到高效液相色譜儀中。結果見表7、表8。

表7 木香烴內酯加樣回收率測定結果

表8 去氫木香內酯加樣回收率測定結果

結果表明：本方法具有較好的加樣回收率。

2.12 提取效率試驗 以甲醇50mL作為提取溶劑進行超聲提取，為保證被測成分提取完全，試驗中考察了超聲提取10min，20min，30min,40min不同超聲提取時間對提取效率的影響，結果見表9、表10。

表9 木香烴內酯提取試驗

表10 去氫木香內酯提取試驗

由表中數據可見，超聲處理30min后，供試品中木香烴內酯及去氫木香內酯的含量趨于穩定，故將提取效率時間定為30min。

3 樣品含量測定

取3批樣品(批號為：71020、802202、802202)每批2份，每份精密稱定約3.82g，另取1批模擬樣2份，每份精密稱定約3.82g，按照“2.3”項下的供試品溶液制備。分別精密量取對照品溶液與供試品溶液，注入高效液相色譜儀，按“2. 1”項下的色譜條件測定，以外標法計算樣品中木香烴內酯和去氫木香內酯的含量，結果見表11、表12。

表11 樣品中木香烴內酯含量測定結果

表12 樣品中去氫木香內酯含量測定結果

續表12 樣品中去氫木香內酯含量測定結果

4 討論

4.1 檢測波長的選擇 精密稱取木香烴內酯和去氫木香內酯對照品適量，于紫外-可見分光光度計上，在190nm～600nm做光譜掃描[3]。結果顯示木香烴內酯和去氫木香內酯在225nm處有最大吸收，并參照中國藥典 “木香”含量測定項下木香烴內酯和去氫木香內酯的測定方法，最終選擇225nm作為檢測波長。

4.2 流動相的選擇 本次實驗使用高效液相色譜法，在實驗過程，筆者參照《中國藥典》2015年版“木香”藥材中木香烴內酯和去氫木香內酯的測定方法，流動相為甲醇-水(65：35)，發現該色譜條件下，分離度好，理論塔板數較高，并具有較適宜的保留時間，故作為檢測流動相。

4.3 提取溶劑的選擇 為了有效提取木香中木香烴內酯和去氫木香內酯，筆者通過參照中國藥典 “木香”項下木香烴內酯和去氫木香內酯含量測定方法，最終選用甲醇作為提取溶劑。并參照內蒙古蒙藥制劑規范，加入甲醇50mL提取較完全。

5 結論

哈敦嘎日迪-13丸是以五靈脂、草烏葉、訶子等13味蒙藥組成的蒙藥制劑。為了更好的控制本品的質量，本研究采用高效液相色譜法，測定哈敦嘎日迪-13丸中木香烴內酯和去氫木香內酯的含量，建立了以木香烴內酯和去氫木香內酯含量為依據的質量標準。并對含量測定指標進行方法學考察，結果表明，此方法簡便易行、專屬性強、分離度好、測定結果準確可靠、靈敏、重現性好[4]，可用于哈敦嘎日迪-13丸的質量控制。