DNA發夾結構自組裝信號放大策略應用的研究進展

俞 蓓，陳時建，徐天雄，占忠旭，賴衛華，許恒毅*

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學 科學技術學院，江西 南昌 330029)

基于核酸的檢測技術因其高特異性和靈敏度被廣泛用于生物小分子、無機金屬離子、核酸和蛋白質分子的分析檢測，然而實際樣品中的被檢物往往痕量，核酸探針與靶標物間通常以1∶1的比例結合，導致傳統利用功能核酸鏈檢測靶物的技術受到限制。近幾年，為進一步提高檢測靈敏度，研究者建立了一系列基于核酸信號放大的檢測方法，將目標物的識別轉化為DNA的擴增。

根據酶的參與與否，信號放大方式可分為基于酶介導的信號放大和無酶介導的信號放大兩類(圖1)。基于酶介導的信號放大主要通過酶的一些特殊功能對核酸進行復制、剪接及修飾以實現對生物活性分子的檢測，該策略可分為熱循環放大型和等溫擴增放大型[1]。其中，以聚合酶鏈式反應(PCR)為代表的熱循環放大型技術作為核酸檢測的“金標準”，可將靶標的量放大108～109倍以利于常規方法的檢測[2]，但該方法需使用昂貴的儀器設備，且易出現交叉污染，從而造成假陰性或假陽性結果[3]。等溫擴增放大型技術如鏈置換擴增(Strand displacement amplification，SDA)[4]、環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[5]、滾環復制(Rolling circle amplification，RCA)[6]和核酸外切酶Ⅲ酶切循環放大(Exonuclease Ⅲ-aided amplification)[7]等雖可進行恒溫擴增，無需特殊加熱設備，但該類方法所用酶的價格昂貴，保存時間較短，且酶活性易受環境影響。

圖1 基于核酸信號放大策略分類Fig.1 Classification of signal amplification based on nucleic acid

相對于酶介導的信號放大，無酶介導的信號放大因操作簡便、選擇性多、反應穩定而在現代分析領域中被廣泛關注。其中，基于DNA發夾結構自組裝的信號放大技術因具有無需酶催化、常溫下可發生反應、無需專業技術人員及擴增設備、檢測特異性強以及靈敏度與PCR相當[8]等優點，近年來在生化、食品和臨床等領域得到迅速發展。本文針對DNA發夾結構自組裝信號放大方法在致病菌、核酸腫瘤標記物、蛋白質、無機金屬離子及生物小分子檢測中的應用進展進行綜述，并對其未來發展趨勢進行了展望。

1 DNA發夾結構自組裝信號放大方式的分類

DNA發夾結構自組裝反應無需酶催化，DNA鏈可通過吉布斯自由能或位形熵的驅動自行組裝，實現信號級聯放大的雜交反應。常用的DNA發夾結構自組裝反應主要有雜交鏈式反應、催化發夾型DNA自組裝反應和熵驅動催化反應。

1.1 雜交鏈式反應

雜交鏈式反應(Hybridization chain reaction，HCR)是一種無需酶催化，常溫下發夾型探針即可被目標DNA鏈“激活”，并不斷雜交產生一條帶有切口的長DNA雙鏈的信號放大方法[9]。其原理如圖2所示，反應體系中兩個發夾型探針H1和H2均由粘性末端(a/c*)、莖部區(b和b*的配對區)及環狀區(c/a*)3部分構成。在無目標鏈存在的情況下，這兩個發夾型探針均以莖環結構穩定存在；當目標鏈a*b*存在時，目標鏈中的a*b*與H1中粘性末端a和莖部b互補，在自由能的驅動下，目標鏈可與H1雜交，并打開H1的莖環結構，從而暴露出cb*序列；同樣地，cb*與H2中粘性末端c*和莖部b互補，然后在自由能的驅動下，將H2的莖環結構打開，從而暴露出與目標鏈相同的a*b*序列，其可作為目標鏈繼續打開H1的莖環結構，反應依次循環進行，產生帶有切口的H1、H2交替互補雜交的長DNA雙鏈。因為反應物的自由能高于生成物的自由能，因此在自由能的驅動下可自發進行該反應，以增強檢測信號。

圖2 HCR原理圖Fig.2 The principle of HCR

1.2 催化發夾型DNA自組裝反應

催化發夾型DNA自組裝反應(Catalyzed hairpin assembly，CHA)是在HCR基礎上發展的一種新型的自由能驅動的發夾型DNA組裝方式。與HCR不同，CHA反應中的目標鏈可被置換并引發下一輪反應，在整個反應中起類似催化劑的作用。根據放大方式不同，CHA可分為線性放大型和指數放大型兩種[10]，線性放大型CHA中發夾型探針通常被目標鏈“激活”后依次進行自組裝，并將目標鏈置換出來，生成穩定的線性雙鏈DNA結構，置換出的目標鏈繼續引發下一輪雜交反應，使檢測信號得到循環放大[11](圖3)；而指數放大型CHA中發夾型探針被目標DNA催化自組裝生成中間物，該中間物又可“激活”下一輪發夾探針同步進行自組裝[12]，從而使檢測信號得到指數式放大。在CHA反應中，發夾型探針被目標鏈“激活”后組裝，不僅可以增強目標鏈的檢測信號，還可以根據不同的設計生成不同構型的雙鏈DNA納米結構組裝體，如組裝形成“Y”型DNA納米組裝體，以滿足不同的實驗需要[12]。

圖3 CHA原理圖Fig.3 The principle of linear CHA

圖4 EDC原理圖Fig.4 The principle of EDC

1.3 熵驅動催化反應

熵驅動催化反應(Entropy drive catalysis，EDC)是一種借助熵驅動實現信號放大的DNA自組裝反應(反應原理見圖4)，引發鏈C先與底物鏈S雜交，生成中間體I1，經重排形成中間體I2，I2因結構域間的結合力較弱分解生成SB和I3，I3繼續與底物F雜交生成中間體I4，I4經重排后分解成OB和I5，I5經重排后置換出引發鏈C并生成復合物W[13]。整個循環反應中因堿基配對未發生變化，故可以忽略自由能的變化，利用位形熵的增加自發進行鏈置換-雜交循環反應，以實現信號放大。

2 DNA發夾結構自組裝信號放大技術的應用

DNA發夾結構自組裝信號放大技術成為當前增強檢測信號的研究熱點，基于此技術建立的各種檢測手段已被廣泛用于致病菌、核酸腫瘤標記物、蛋白質、生物小分子以及無機金屬離子的檢測。表1詳細總結了DNA發夾結構自組裝信號放大技術在不同物質檢測中的應用。

表1 DNA發夾結構自組裝信號放大技術在不同被檢物檢測中的應用Table 1 The application of DNA self-assembly for the detection of different samples

2.1 致病菌檢測

2.1.1致病菌全菌檢測DNA自組裝信號放大方法主要以兩種形式實現對致病菌全菌的檢測:①根據目標菌的核酸適配子設計發夾探針，實現自發組裝，并通過循環反應實現信號放大。②信號輸出方式中引入DNA自組裝反應，以實現檢測信號的放大。Guo等[14]建立了一種HCR參與的檢測大腸桿菌O157∶H7的雙抗夾心免疫法，抗體和寡核苷酸雙標記的納米金探針通過HCR產生一條長的帶有大量生物素的雙鏈DNA，通過生物素-鏈霉親和素的作用力與鏈霉親和素修飾的HRP酶連接，從而增強檢測信號。該方法對純培養的大腸桿菌O157∶H7的檢測限可達1.08×102CFU/mL，較傳統的ELISA法靈敏度提高了185倍。Chen等[15]結合CHA信號放大策略，構建了一種基于核酸適配體的檢測鼠傷寒沙門氏菌的過氧化物模擬酶比色傳感器，其將G-四聯體序列部分隱藏在發夾結構中，在有鼠傷寒沙門氏菌存在的情況下，核酸適配體與其結合并釋放CHA引發序列催化發夾自組裝，暴露出的完整G-四聯體序列可與氯化高鐵血紅素結合形成過氧化物模擬酶，在H2O2存在下，催化底物2,2′-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS2-)顯色。該法在PBS中的檢測限為103CFU/mL，檢測僅需2 h。

2.1.2致病菌核酸檢測利用DNA自組裝信號放大技術對致病菌核酸進行檢測時，首先需針對靶核苷酸序列設計兩個至多個與之對應的特異性自組裝發夾型探針，然后加入靶DNA引發DNA發夾自組裝，最后通過不同的檢測手段對反應終產物進行檢測。Ying等[16]以沙門氏菌的16S rRNA基因為靶序列，結合膠體金免疫層析法和HCR信號放大的方法對其檢測，該方法對沙門氏菌的檢測限為3×103CFU/mL；對靶DNA的檢測限可達1.76 pmol/L，比未經HCR放大的檢測限低2個數量級。Ma等[17]利用納米金聚集與分散而引起顏色變化的性質，結合指數放大型CHA(EHA)，實現了對副溶血性弧菌基因組DNA中部分保守序列的裸眼檢測，15 min內可實現裸眼檢測且對靶DNA的檢測限達25 pmol/L，較傳統的納米金比色法的靈敏度提高了約400倍。Chen等[15]構建了基于CHA信號放大的過氧化物模擬酶比色傳感器，實現了對肺炎鏈球菌lytA的超靈敏檢測，在純培養液中肺炎鏈球菌的檢測限為156 CFU/mL，對靶DNA的檢測限達32 pmol/L，可實現裸眼檢測。Yu等[37]以產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的嘔吐毒素編碼基因(cesB)部分片段為靶序列，結合HCR信號放大方法和流式細胞術對其檢測，在純培養液中產嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的檢測限為7.6×100CFU/mL，牛奶加標樣中的檢測限為9.2×102CFU/mL。

2.2 核酸腫瘤標記物檢測

微小核糖核酸(miRNAs)是一類具有調控功能的內源性的非編碼單鏈RNA分子。miRNAs的異常表達與一些癌癥(肺癌、胃癌、乳腺癌等)的發生密切相關，已被當作新型的腫瘤標記物。Northern印跡雜交雖作為miRNAs檢測的金標準[38]，但費時費力且靈敏度低。DNA自組裝信號放大技術簡單易操作且特異性強，被引入易突變的miRNAs檢測體系中。Wu等[39]將G-四聯體序列一分為二，分別設計在兩個自組裝發夾型探針中，當let-7a存在時，可引發HCR反應，從而將G-四聯體的兩部分結合形成完整序列，并與氯化血紅素結合形成具有辣根過氧化物酶活性的DNA模擬酶，催化H2O2和ABTS2-顯色，該方法在let-7a濃度為10 fmol/L～10 nmol/L范圍內具有良好的線性關系，對let-7a的檢測限為7.4 fmol/L，且可以識別單堿基突變。Zhai等[18]將HCR輔助的信號放大與電化學傳感器相結合，將捕獲探針固定在納米金修飾的電極上，捕獲miRNA-21引發擴增的HCR反應產物，并將其作為電化學信號的載體，實現了對miRNA-21的超靈敏檢測。該方法具有良好的特異性，線性范圍為1 fmol/L～100 pmol/L，對miRNA的檢測限可達0.56 fmol/L，檢測時間為2.5 h。Miao等[40]建立了一種基于帶正電納米金和HCR信號放大的miRNA檢測方法，只有miRNA-21存在時才可啟動HCR形成很長的dsDNA，其可通過靜電吸附與帶正電的納米金結合，從而使納米金沉淀，并根據此變化實現對miRNA-21的檢測。該方法特異性強，對miRNA-21的檢測限為6.8 pmol/L，線性范圍為20 pmol/L～10 nmol/L。

2.3 蛋白質檢測

蛋白質作為生命體內重要的生物大分子，不僅能夠調控細胞代謝，還能作為生物標志物監控疾病的發生。蛋白質的常用檢測方法主要是基于抗原-抗體的特異性識別的標記免疫分析法，但其操作復雜、成本高且需專業操作人員[41]。隨著指數富集的配體系統進化技術(SELEX)的發展，越來越多的靶標蛋白適配體被成功篩選出來。作為新型的分子識別元件，核酸適配體在蛋白質檢測的應用中受到廣泛關注。Wang課題組[42-43]依據核酸適配體與癌胚抗原(CEA)間的親和力，分別構建了基于納米金-辣根過氧化物酶復合物信號放大的膠體金適配子試紙條，以及基于適配體-納米金探針與石墨烯-鏈霉親和素納米復合物的夾心型電化學適配體型傳感器，實現了對CEA的靈敏檢測。然而，核酸適配體與目標物通常以1∶1結合，導致檢測限高，故DNA自組裝信號放大技術被引入以增強檢測信號，提高靈敏度。Yang等[44]基于核酸適配體的HCR和CHA雙重信號放大策略，構建了檢測CEA的熒光傳感器，其檢測限可達0.3 pg/mL。Lu等[45]將基于核酸適配體的CHA和Exo-Ⅲ酶切循環放大策略與熒光傳感器相結合，通過熒光信號變化實現了對CEA的檢測,該方法對CEA的檢測限達58 fg/mL。Wang等[23]利用基于核酸適配體的HCR信號放大，結合氧化石墨烯建立了血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)的靈敏檢測方法，其將PDGF-BB的核酸適配體隱藏在發夾DNA中，當PDGF-BB存在時，核酸適配體與其結合并暴露出能引發HCR的序列，催化發夾結構的自組裝，形成長的雙鏈DNA，隨后加入熒光染料SYBR Green I嵌入dsDNA間，產生熒光信號。該方法靈敏度高，檢測限為1.25 pmol/L。Zhao等[8]構建了一種HCR參與的檢測葉酸受體的雙鏈DNA-銅納米顆粒生物傳感器，將捕獲探針固定在納米金修飾的電極上，捕獲葉酸受體引發擴增的HCR反應產物，并將其作為dsDNA-CuNPs復合物產生的模板，進而合成CuNPs。電極表面的CuNPs被硝酸溶解后，產生的銅離子催化底物o-鄰苯二胺(OPD)生成具有電活性的2,3-二氨基吩嗪(DAP)，并通過電化學信號檢測葉酸受體。該方法特異性強，檢出限為3 pg/mL，線性范圍為0.01～100 ng/mL。Bai等[46]發明了一種基于核酸適配體和CHA輔助放大的檢測α-凝血酶的過氧化物模擬酶比色傳感器，該方法對α-凝血酶的檢測限為0.68 pmol/L，線性范圍為1 pmol/L～2.5 nmol/L。

2.4 生物小分子檢測

DNA發夾結構自組裝信號放大策略主要通過結合核酸適配體技術實現對小分子的檢測。Gao等[47]建立了一種基于核酸適配體和HCR輔助下信號放大的方法用于ATP檢測，ATP可與核酸適配體結合，使非適配體部分序列暴露出來，從而引發HCR反應，形成的長鏈DNA分子可使納米金聚集，從而產生顏色變化實現ATP的檢測，該方法對ATP的檢測限為1 nmol/L。Sun等[48]基于核酸適配體的HCR和核酸外切酶Ⅲ(Exo-Ⅲ)雙重信號放大策略，構建了檢測腺苷的過氧化物模擬酶比色傳感器，檢測限可達4.2×10-7mol/L。Huang等[29]將基于核酸適配體的CHA信號放大策略與熒光傳感器相結合，在發夾型探針H1的5′端標記了芘分子，以CHA產物作為載體，通過熒光信號變化實現了對腺苷的檢測。該方法對腺苷的檢測限達42 nmol/L，并成功應用于人血清樣本中腺苷的檢測。Wang等[49]結合HCR信號放大策略，構建了一種基于核酸適配體的過氧化物模擬酶比色傳感器來檢測赭曲霉毒素A(OTA)，其檢測限可達0.01 nmol/L，線性范圍為0.01～0.32 nmol/L。

2.5 無機金屬離子檢測

重金屬離子Pb2+和Hg2+等廣泛存在于自然界中，能通過生物富集作用以不同途徑嚴重危害人體健康。基于DNA自組裝信號放大的檢測技術可以實現無機金屬離子的痕量檢測而被廣泛應用。Zhuang等[50]將Pb2+特定的脫氧核酶固定在磁珠上，當Pb2+存在時，其可與脫氧核酶發生特異性作用，通過切割rRNA序列將功能酶底物剪切成兩部分，其中連接在磁珠表面的殘余核酸序列可通過HCR反應形成連有大量二茂鐵的雙鏈DNA，并通過電化學信號的改變實現對Pb2+的定量檢測。該方法對Pb2+的檢測限為37 pmol/L，線性范圍為0.1～75 nmol/L。根據相同原理，Chen等[36]建立了一種基于脫氧核酶和CHA信號放大的Pb2+檢測的膠體金免疫層析法，檢測限為10 pmol/L，較未經信號放大的試紙條法，其檢測限降低4個數量級。Huang等[51]構建了一種基于HCR輔助的信號放大策略檢測Hg2+的熒光傳感器，并引入氧化石墨烯作為猝滅劑降低背景信號，當加入Hg2+時，利用T-Hg2+-T配對連接在引發鏈和發夾型探針H1間，啟動HCR反應并產生帶有大量熒光基團FAM的雙鏈DNA，實現了熒光信號放大，該方法對Hg2+的檢測限達0.3 nmol/L，且具有良好的特異性。Wang等[52]建立了一種基于HCR信號放大的納米金比色檢測方法，當Hg2+存在時，其利用T-Hg2+-T配對打開發夾型探針H0，進而觸發HCR反應，從而使納米金聚集，并通過顏色變化實現對Hg2+的裸眼檢測。該方法對Hg2+的檢測限為30 nmol/L，較未經修飾的納米金比色法，其檢測限低1～2個數量級。

3 總結與展望

DNA發夾結構自組裝作為近幾年迅速發展的信號放大方法，因具有無酶參與、等溫和識別序列能力強等優點，在致病菌、核酸腫瘤標記物、蛋白質和無機金屬離子等分析檢測方面展現了良好的應用前景。然而在基于DNA發夾結構自組裝信號放大策略的生物分子檢測中，仍存在一些問題亟待解決:①DNA發夾結構自組裝信號放大效率與發夾探針的設計有關[16]，目前針對發夾探針設計的具體操作鮮見報道，開發設計并評估發夾探針效果的軟件尤為迫切；②單獨使用DNA發夾結構自組裝信號放大策略實現高靈敏檢測的研究不多，未來可將幾種DNA發夾結構自組裝信號放大策略聯用或與其他無酶信號放大方法結合，以實現檢測信號的多重放大；③探尋其他檢測手段或信號放大技術(如共聚焦顯微鏡、拉曼散射等)與DNA發夾結構自組裝信號放大策略聯用，以提高檢測的靈敏度及特異性，為目標物檢測提供一個無酶、免標記、高特異性和靈敏度的檢測平臺。隨著技術的不斷發展，DNA發夾結構自組裝信號放大策略將朝著即時、靈敏、高特異性的方向發展，最大程度地實現其應用價值。