敲除鼻咽癌SU NE-1-6-10 B細胞株中的K i SS-1基因對裸鼠肺轉移的影響

張磊，江浩

（蚌埠醫學院第一附屬醫院放療科，安徽 蚌埠 233000）

目前，鼻咽癌經治療后的5年生存率在70%左右，引起治療失敗的主要原因是癌細胞的局部破壞和遠處轉移。其中，因遠處轉移導致的治療失敗占失敗總數的35%～46%。KiSS-1基因是Lee等［1］發現的一個轉移抑制基因，定位于人類染色體1q32-q41，其表達產物（Kisspeptin）可以明顯抑制惡性黑色素瘤細胞的浸潤和轉移能力。近年來的研究表明，該基因的表達與胰腺癌［2］、滋養層細胞腫瘤［3-4］、泌尿上皮腫瘤［5-6］、肝癌［7］、非小細胞肺癌［8］、乳腺癌［9-10］等惡性腫瘤的轉移緊密相關。但KiSS-1基因與鼻咽癌轉移的關系卻鮮有報道。

本實驗利用CRISPR/Cas9基因敲除技術［11-12］對低轉移能力的SUNE-1-6-10B鼻咽癌細胞株進行KiSS-1基因敲除實驗，其基因敲除是否成功采用Surveyor法和Western blot技術從基因和蛋白表達水平進行驗證。最后，將KiSS-1基因敲除的細胞株和正常的鼻咽癌細胞株分別接種于裸鼠腋下，觀察其成瘤和肺轉移情況，揭示KiSS-1基因與鼻咽癌肺轉移的關系，從而推斷KiSS-1基因對鼻咽癌肺轉移的影響，為臨床中預測鼻咽癌患者是否發生轉移、個體化治療以及應用腫瘤轉移抑制基因進行早期干預治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1．1 材料 SUNE-1-6-10B細胞株（中科院上海細胞庫），RPMI 1640培養基（美國Thermo公司），胎牛血清（美國Gibco公司），慢病毒LVCas9-Puro和LV-sgRNA-EGFPMCS（上海吉凱基因化學技術有限公司），Surveyor檢測試劑盒（上海吉盛醫學科技有限公司），Western blot試劑盒（碧云天生物技術研究所）。

1．2 實驗動物 40只BALB/c-nu裸鼠，4～6周齡，雌性，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司。生產許可證號SCXK（京）2012-0001，合格證號11400700092857。

1．3 方法

1．3．1 細胞培養與慢病毒轉染 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養SUNE-1-6-10B細胞，37℃5%CO2培養箱中恒溫培養。轉染前將SUNE-1-6-10B細胞種于6孔板中，待細胞密度達到60%～70%時進行轉染。

針對KiSS-1基因作用的功能域設計CRISPR／Cas9作用靶點，構建sgRNA的表達質粒。sgRNA序列的設計參考哈佛大學張峰實驗室提供的網站（http：//crispr．mit．edu/）。sgRNA 序列為5'-GGGAACCACGGCAGAAGCGC-3′。本實驗使用的LV-Cas9-Puro（帶有嘌呤霉素標記）和LV-sgRNA-EGFPMCS（帶有綠色熒光標記）均由上海吉凱基因化學技術有限公司合成。

轉染過程：將SUNE-1-6-10B細胞密度調整至4×104/ml，吸取細胞懸液至6孔板，每孔2 ml。1 d后，將LV-Cas9-Puro慢病毒懸液（2×108TU/ml，75 μl）、Eni．S 溶 液（80 μl）和 polybrene 溶 液（10 μl）加入其中，于37 ℃ 5%CO2培養箱培養。轉染3 d后使用濃度為0．6 μg/ml嘌呤霉素溶液篩選轉染細胞。最后，將LV-sgRNA-EGFPMCS慢病毒懸液（2×107TU/ml，125 μl）和 polybrene溶液（10 μl）加入其中，于37 ℃ 5%CO2培養箱培養，定期更換培養液。

1．3．2 Surveyor法檢測 根據DNA提取試劑盒中的步驟，提取慢病毒轉染后的SUNE-1-6-10B細胞基因組。基因組DNA加入上下游引物，進行PCR擴增。設計的PCR擴增引物，上游引物：5'-TGCACCGAGAGGAAGCCAGCTGCTA-3'，下 游引物：5'-CGCAGACCACACGTCAGTGAGTTAC-3'。酶切篩選陽性克隆：在滅菌PCR管中配制反應體系：PCR 產物 3．0 μl、Detecase Buffer 2．0 μl、Detecase 1．0 μl、蒸 餾 水 4．0 μl，45 ℃ 反 應 20 min。結束后，立即向上述10 μl體系內加入2 μl終止液，隨后進行2%瓊脂糖凝膠，105 V 25 min電泳檢測。電泳過程中注意觀察內標（Marker），待其條帶明顯分開后，結束電泳。小心取出凝膠，將其放于UVP凝膠成像儀（美國 Bio-Rad公司，VersaDoc 3000）中。調整參數，觀察電泳結果。

1．3．3 Western blot檢測 利用含蛋白酶抑制劑（美國Sigma公司）的裂解緩沖液裂解細胞懸液。使用BCA蛋白定量試劑盒（天根生化科技有限公司）對提取的蛋白進行定量。取相同質量的蛋白質（40 μg）電泳分離，電轉膜儀轉膜，封閉后加入一抗：抗KiSS-1抗體（美國Santa Cruz公司），β-Actin（美國Santa Cruz公司），4℃孵育過夜，加入二抗。ECL顯色液顯色，分析比較記錄。

1．3．4 SUNE-1-6-10B細胞接種裸鼠腋下，觀察肺轉移灶情況 實驗組20只裸鼠使用0．2 ml濃度5×106/ml Kiss-1基因敲除的SUNE-1-6-10B細胞株接種于腋下；對照組20只裸鼠使用0．2 ml濃度5×106/ml KiSS-1基因未敲除的SUNE-1-6-10B細胞株接種于腋下。裸鼠全部被飼養于無特殊病原體（SPF）環境。25 d后，經頸椎脫臼法處死裸鼠，并將裸鼠的腋下腫瘤和肺臟取出，測量腋下腫瘤的重量，計錄出現肺部轉移灶裸鼠只數。

1．4 統計學方法 采用SPSS 13．0統計學軟件進行數據分析，以［n（%）］表示計數資料，組間比較采用χ2檢驗；采用均數±標準差表示計量資料，組間比較采用t檢驗。α＝0．05為檢驗的標準，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 KiSS-1基因敲除細胞株的建立 細胞株平均2～3 d傳代一次，細胞形態正常，生長良好，見圖1。

圖1 倒置光學顯微鏡下的SUNE-1-6-10B鼻咽癌細胞株

CRISPR/Cas9雙載體慢病毒體系通過2個慢病毒載體分別向細胞導入Cas9蛋白和sgRNA序列表達框，依次轉染LV-Cas9-Puro和LV-sgRNAEGFPMCS后，將細胞培養瓶置于熒光顯微鏡下，可見慢病毒轉染效率＞95%，見圖2。

圖2 白光下（×200）和熒光顯微鏡下（×200）同一視野的鼻咽癌細胞用于觀察慢病毒轉染效率

2．2 Surveyor驗證 結果顯示在實驗組和對照組均能檢測到與預計大小相符的目的條帶。經錯配酶消化后，在實驗組（轉染LV-Cas9-puro/LV-sgRNA-EGFPMCS）的電泳結果顯示出現2條額外的231 bp和190 bp的片段，與預計大小相符。見圖3。

圖3 KiSS-1基因敲除成功與否的Surveyor驗證

2．3 Western blot檢 測 KiSS-1基 因 通 過CRISPR/Cas9技術敲除后，先提取Kisspeptin蛋白，再用Western blot的方法完成對該蛋白含量的檢測。結果發現Kisspeptin蛋白在敲除了KiSS-1基因的鼻咽癌細胞中呈低表達。見圖4。

圖4 Western blot檢測Kisspeptin蛋白含量

2．4 裸鼠腋下移植瘤以及肺組織轉移灶 裸鼠腋下接種人鼻咽癌細胞株25 d后，將裸鼠處死，檢查發現腋下成瘤率為100%，見圖5。

實驗組、對照組裸鼠腋下移植瘤平均重量分別為（6．72±0．37）g、（6．80±0．38）g，差異無統計學意義（P＞0．05）。實驗組20只裸鼠中有8只裸鼠出現肺轉移灶，肺轉移率為40%；對照組20只裸鼠中有2只裸鼠出現肺轉移灶，肺轉移率為10%，差異有統計學意義（χ2=4．800，P＜0．05）。

圖5 裸鼠腋下移植瘤以及肺組織轉移灶

3 討論

與其他惡性腫瘤一樣，鼻咽癌患者治療期間的遠處轉移成為臨床治愈的一大障礙，而目前對于鼻咽癌轉移的治療手段相對匱乏，所以研究鼻咽癌遠處轉移治療的新方法就顯得格外迫切。

KiSS-1基因是眾多轉移抑制基因之一，其轉移抑制作用最先發現于人黑色素瘤細胞。該基因轉錄翻譯生成的Kisspeptin蛋白在惡性腫瘤的發生、轉移以及生殖功能調節等方面都起著重要作用。

本課題組前期的研究表明，KiSS-1基因在非腫瘤性鼻咽上皮高表達，而在鼻咽癌組織中表達降低，KiSS-1基因表達降低會增加鼻咽癌患者的轉移機率［13］。后續的實驗研究結果進一步表明，在低轉移能力的SUNE-1-6-10B細胞株中KiSS-1基因在mRNA水平和蛋白質水平的表達都顯著高于其他具有較高轉移性細胞株中的表達［14］。

CRISPR/Cas9技術是近年來一種新興的基因敲除技術。國內外很多學者已經用此種方法對目標靶基因成功進行了敲除。但鮮有學者對KiSS-1基因進行敲除，并揭示KiSS-1基因缺失與腫瘤轉移的關系。

本實驗使用的鼻咽癌細胞經敲除KiSS-1基因后，經Surveyor法驗證，實驗組和對照組均能檢測到與預計大小相符的目的條帶。經錯配酶消化后，實驗組電泳后出現2條額外的231 bp和190 bp的片段，與預計大小相符，說明部分鼻咽癌細胞的基因組序列因為產生了由CRISPR/Cas9系統誘發的隨機插入或刪除的非同源重組的末端修飾，從而導致基因組突變，而在PCR產物經緩慢退火時不能完全配對，因此能被錯配酶識別從而切斷成2條小的DNA片段，證實CRISPR/Cas9系統成功在SUNE-1-6-10B細胞基因組上導致定點突變。與此同時，Western blot檢測結果發現，基因敲除后的鼻咽癌細胞表達Kispepttin蛋白明顯減少，說明基因敲除導致轉錄生成的mRNA減少，進而翻譯生成的蛋白質也將相應減少。最后的裸鼠移植瘤實驗結果表明，在敲除KiSS-1基因后，皮下移植瘤的大小未出現差異，而腫瘤肺轉移灶的個數有所提升，這說明KiSS-1基因對腫瘤的成瘤無明顯影響，而對于鼻咽癌細胞肺轉移具有一定的抑制作用。

本實驗為研究KiSS-1基因對鼻咽癌細胞株的轉移性進行了一次有益的嘗試，為臨床上鼻咽癌肺轉移患者的靶向治療提供了一定的實驗基礎。