人脂肪干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

李玉秋，張雷雷，黃飛

（山東華思生物科技有限公司，山東 煙臺(tái) 264003）

脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是2001年Zuk等［1］從真空吸脂術(shù)抽出的脂肪中發(fā)現(xiàn)的一種間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs），其含量約占脂肪組織的10%～20%［2］。ADSCs同其他 MSCs一樣，具有自我更新和多向分化的潛能，是成體干細(xì)胞的一種，在疾病治療領(lǐng)域有巨大的潛力。但ADSCs較骨髓干細(xì)胞有更高的提取率，其提取率可高達(dá)1%～2%，是骨髓干細(xì)胞的1 000倍［3］。ADSCs已成為研究者們青睞的種子細(xì)胞，本文就ADSCs的提取、培養(yǎng)和鑒定進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 脂肪組織 選取濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦皮下脂肪組織，產(chǎn)婦無(wú)其他基礎(chǔ)疾病，未經(jīng)過(guò)特殊藥物治療，取材前均獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和產(chǎn)婦知情同意。

1．1．2 試 劑 低 糖 DMEM 培 養(yǎng) 基（Gibco，美國(guó)）、胎牛血清（FBS，Hyclone，美國(guó)）、Ⅰ型膠原酶（索萊寶，中國(guó)）、胰蛋白酶（Gibco，美國(guó)）、磷酸鹽緩沖液（PBS，Hyclone，美國(guó)）、青霉素-鏈霉素（索萊寶，中國(guó)）、CD44-FITC抗體（eBioscience，美國(guó)）、CD105-PE（eBioscience，美國(guó)）、CD34-APC抗體（eBioscience，美國(guó)）、CD45-PerCPCyanine5．5抗體（eBioscience，美國(guó)）。

1．1．3 儀器 CO2培養(yǎng)箱（Thermo Scientific，美國(guó)）、生物安全柜（香港力康，中國(guó)）、低速多管大容量離心機(jī)（上海安亭，中國(guó)）、手術(shù)器械（新華，中國(guó)）、70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)（索萊寶，中國(guó)）、細(xì)胞培養(yǎng)皿（Corning，美國(guó)）、超低溫冰箱（Thermo Scientific，美國(guó)）、流式細(xì)胞儀（BD，美國(guó)）等。

1．2 方法

1．2．1 ADSCs提取 （1）將無(wú)菌條件下用真空抽脂術(shù)提取的腹部皮下脂肪，在生物安全柜內(nèi)取約5 g，用含有500 U/ml雙抗的PBS充分漂洗3遍，剔除肉眼可見(jiàn)的血管及結(jié)締組織，用眼科剪將其充分剪碎，再用PBS反復(fù)沖洗，盡量除去紅細(xì)胞。（2）加入2倍體積的0．2%Ⅰ型膠原酶，振蕩混勻后，于37℃的恒溫水浴箱消化60 min。（3）加入等體積的含有10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基終止消化。（4）1 800 r/min離心10 min（離心后分為3層，上層為油脂及未消化完全的脂肪組織，中層為上清液，下層為脂肪干細(xì)胞和紅細(xì)胞等混合細(xì)胞的沉淀）。（5）棄上層和中層，加入2 ml完全培養(yǎng)基（低糖DMEM+10%FBS+100 U/ml青霉素-鏈霉素）重懸細(xì)胞沉淀，70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，將濾過(guò)后的濾液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/L接種至60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1．2．2 ADSCs培養(yǎng)、傳代 將提取的原代ADSCs培養(yǎng)24 h后進(jìn)行半量換液，48 h后進(jìn)行全量換液，去除殘存的紅細(xì)胞、細(xì)胞碎片等。之后每2 d換液1次，獲得純化后的ADSCs，培養(yǎng)7～9 d后，原代ADSCs可生長(zhǎng)融合達(dá)到90%，用0．25%胰蛋白酶（含有0．2%EDTA）常規(guī)消化后，1∶3傳代接種到新的細(xì)胞培養(yǎng)皿中持續(xù)體外擴(kuò)增培養(yǎng)。

1．2．3 流式細(xì)胞術(shù)鑒定ADSCs標(biāo)志物 取第3代ADSCs鑒定細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物CD34、CD44、CD45、CD105，實(shí)驗(yàn)步驟：（1）ADSCs用胰酶消化后，1 000 r/min離心4 min，用PBS重懸，計(jì)數(shù)，每個(gè)2 ml EP管取細(xì)胞3×105個(gè)細(xì)胞，1 000 r/min離心 4 min，棄上清，加入 50 μl或100 μl PBS重懸。（2）細(xì)胞與抗體孵育：a.空白細(xì)胞對(duì)照組：加入50 μl PBS；b.加入1 μl CD44-FITC抗體+99μl PBS；c.加入2.5μl CD105-PE抗體+47.5μl PBS；d.加入2.5μl CD34-APC抗體+47.5 μl PBS；e.加入 2.5 μl CD45-PerCPCyanine5.5抗體+47.5 μl PBS；f.將上述4種抗體分別取1 μl、5 μl、5 μl、5 μl加入細(xì)胞中+84 μl PBS。4℃避光孵育45 min（每隔15 min搖晃1次）。（3）孵育完后，加入1 ml PBS重懸，1 000 r/min離心4 min，棄上清，加入1 ml PBS再洗一遍，最終加入200μl PBS重懸。（4）應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2．1 ADSCs提取 通過(guò)膠原酶法提取得到了ADSCs，提取過(guò)程見(jiàn)圖1A。提取的原代ADSCs生長(zhǎng)狀況見(jiàn)圖1B-F。ADSCs呈貼壁生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，其呈現(xiàn)出纖長(zhǎng)的纖維細(xì)胞樣。

圖1 原代ADSCs的提取

2．2 ADSCs培養(yǎng) 傳代后的ADSCs接種24 h后，細(xì)胞已貼壁，呈圓形、短梭形或者多角形，大小不一；待細(xì)胞進(jìn)入增殖期時(shí)，ADSCs逐漸伸展呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形，排列緊密，呈漩渦狀生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)與成纖維細(xì)胞相似，大小均一，多角形及圓形細(xì)胞少見(jiàn)，見(jiàn)圖2。

圖2 光鏡下觀察原代ADSCs的培養(yǎng)（×100）

2．3 ADSCs鑒定 成熟后的ADSCs，用流式細(xì)胞術(shù)鑒定ADSCs的細(xì)胞表面特異性標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)CD44和CD105表達(dá)陽(yáng)性，CD34為低表達(dá)，CD45表達(dá)為陰性，見(jiàn)圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)鑒定ADSCs的特異性標(biāo)記物

3 討論

ADSCs是從脂肪組織中提取出來(lái)的具有多能分化潛能的成體干細(xì)胞，擁有來(lái)源充足、取材方便、操作簡(jiǎn)單、體外易培養(yǎng)、生物學(xué)性狀穩(wěn)定、免疫原性低、不受倫理學(xué)限制等優(yōu)點(diǎn)，因此是組織工程學(xué)應(yīng)用較為廣泛的的種子細(xì)胞［4］。隨著細(xì)胞治療的發(fā)展，ADSCs在治療、康復(fù)、美容等領(lǐng)域均具有較大的應(yīng)用潛力。ADSCs作為人體組織工程中最大的成體干細(xì)胞庫(kù)，將成為干細(xì)胞應(yīng)用領(lǐng)域中理想的細(xì)胞來(lái)源［5］。

ADSCs提取方法有很多，劉琴等［6］對(duì)其提取分離方法進(jìn)行總結(jié)，主要包括了組織塊貼壁法、膠原酶消化法、機(jī)械分離法（直接離心法、震蕩離心法、旋渦離心法、吸附柱法、超聲處理法）、膠原酶結(jié)合組織塊貼壁法、懸浮培養(yǎng)法等，其中膠原酶消化法提取的ADSCs，其轉(zhuǎn)化成骨的的能力更強(qiáng)［7］。采用膠原酶法消化離心脂肪組織所獲得的沉淀稱(chēng)為基質(zhì)血管成分（stromal vascular fraction，SVF），SVF中除了需要的ADSCs外，還有脂肪前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、造血干細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、免疫細(xì)胞等［3］。因?yàn)镾VF中大多數(shù)細(xì)胞在培養(yǎng)液中處于漂浮狀態(tài)無(wú)法貼壁［8］，所以膠原酶法提取的SVF原代培養(yǎng)48 h，再經(jīng)換液后，獲得的所有的貼壁活細(xì)胞均為ADSCs［9］。為了進(jìn)一步鑒定ADSCs，特異性的標(biāo)記物是最理想的條件，但是由于各種因素的影響，目前尚未明確ADSCs的特異性標(biāo)記物［10］。2013年，國(guó)際脂肪治療科學(xué)聯(lián)合會(huì)（IFATS）和國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)（ISCT）聯(lián)合宣布：ADSCs新分離的表型為CD31-/CD34+/CD45-/CD235a-，而體外培養(yǎng)表型為CD31-/CD44+/CD45-/CD73+/CD90+/CD105+［11］，也有研究發(fā)現(xiàn)CD34為低表達(dá)［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)，采用膠原酶法可以很好地提取ADSCs，經(jīng)過(guò)原代培養(yǎng)換液，可以獲得較純的ADSCs，且經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞術(shù)鑒定后，發(fā)現(xiàn)其表面標(biāo)志物為CD34+/CD44+/CD45-/CD105+，其中CD34為低表達(dá)。

通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，采用消化酶法可以成功提取ADSCs，且其性狀相對(duì)穩(wěn)定，易于培養(yǎng)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)鑒定其表面標(biāo)記物，可證明本研究提取的細(xì)胞為ADSCs。用此方法可以較便捷地提取ADSCs，便于后續(xù)的轉(zhuǎn)化分析的研究。

（致謝：感謝濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科提供正常產(chǎn)婦來(lái)源的腹壁皮下脂肪）