黃芩素作為佐劑對黑色素瘤小鼠體內T細胞免疫應答的增強作用

劉 瑋，劉澤媛，齊好雯，王 斌

惡性黑色素瘤是來源于黑色素細胞的一種高度惡性的腫瘤，發病率為全部惡性腫瘤的1%～3%，黑色素瘤比其他惡性腫瘤發病速度快。與一些更常見的皮膚惡性腫瘤 （如鱗狀細胞癌和基底細胞癌等）不同，黑色素瘤具有不斷增殖的能力，化學療法和放射治療等常規腫瘤治療方法敏感性很差［1-3］。細胞因子，干擾素和白細胞介素-2顯示出了免疫治療在治療黑色素瘤中的潛力，然而這些治療具有高毒性、低反應率，患者平均生存期無改善。以前的研究表明，腫瘤淋巴細胞的浸潤可能與改善的結果有關，然而淋巴細胞抗癌活性有明顯的障礙，包括腫瘤和其他炎癥細胞的淋巴細胞調控［4］。重要的突破是在T細胞淋巴細胞上鑒定和激活靶向調控蛋白“開關”。所以，急需找到一種不良反應小、能增強弱免疫原性腫瘤抗原所誘發的保護性抗瘤效應的新型佐劑，來對T細胞進行激活進而發揮作用，從而達到抑制腫瘤的效果。

在免疫反應中，天然的反應開始于血管壁中單核細胞/巨噬細胞的活化，其次是由T和B細胞介導的更具體的適應性反應［5，6］。 在早期病變中，發現巨噬細胞豐富。由巨噬細胞集落刺激因子和各種其他細胞因子刺激，這些細胞上調其模式識別受體并介導脂蛋白內化［7］。巨噬細胞是炎性細胞因子TNF的來源，其通過在病變部位招募更多的T細胞、B細胞和巨噬細胞［8］。在成熟病變中，由T細胞和B細胞介導的免疫應答可能成為消除癌癥的主要力量。

黃芩素（5，6，7-三羥基福酮）是黃芩中主要的生物活性物質，屬于黃酮類。黃芩素由于抗癌功能低毒，并具有增殖抑制，細胞凋亡誘導，自噬細胞死亡［9-13］及其抗轉移活性［14，15］，引起了越來越多的 關注。到目前為止，在許多癌癥中已經證明了黃芩素的抗癌作用，在膀胱癌中，黃芩素可以通過抑制CDC2激酶活性來延緩細胞生長［9］，降低細胞周期蛋白B1和D1蛋白表達水平；在乳腺癌中，黃芩苷有可能通過抑制基質金屬蛋白酶2/9（MMP-2/9）的表達和分泌來抑制癌細胞的黏附，遷移和侵襲［16］；在胃癌中，癌細胞通過TGF-β和p38信號通路進行遷移和侵襲，黃芩素可達到抑制TGF-β和p38信號通路的作用［17，18］；在胰腺癌細胞中，黃芩素可通過下調抗凋亡蛋白MCL-1誘導凋亡細胞死亡［10］；在皮膚癌中，黃芩素可通過抑制錨蛋白Ezrin表達來抑制細胞侵襲［19］；在結腸直腸癌中，黃芩素可以通過抑制AKT信號通路降低MMP-2和MMP-9的表達來抑制細胞遷移和侵襲［20］。此外，He等發現黃芩素可以通過Wnt信號靶向c-MYC基因來抑制骨肉瘤細胞增殖并促進細胞凋亡［21］，但其作為佐劑應用于黑色素瘤的研究還目前還沒有報道。該實驗將黃芩素用于黑色素瘤模型中，用于檢測其在黑色素瘤中對T細胞的作用研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和細胞株 C57BL/6小鼠，雌性，6～8周齡，購自南京君科生物工程有限公司；B16F10細胞系購自中國科學院上海細胞資源中心。

1.1.2 試劑及儀器 黃芩素標準品（大連美侖生物技術有限公司）；弗式完全佐劑（sigma公司）；用于流式檢測的抗體 PE anti-mouse IL-2，PE antimouse TNF-α，PE anti-mouse IFN-γ 都從 Biolegend公司購買；-86℃超低溫冰箱（SANYO，日本）；細胞培養箱 （北京五洲東方科技發展有限公司）；SWCJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 （蘇州凈化設備有限公司）；冰箱 （青島澳柯瑪集團）；BD Accuri C6 software流式細胞儀。

1.2 方 法

1.2.1 不同濃度黃芩素的配制及C57BL/6小鼠的分組 使用甲醇溶液溶解黃芩素標準品，溶解后的濃度為1 mg/ml。將C57BL/6小鼠分為8組，分別為A、B、C、D、E、F、G 和 H 組，每組 5 只。

1.2.2 黑色素瘤滅活疫苗的制備 將黑色素瘤細胞B16F10放于含5%CO2的37℃細胞培養箱中培養，待細胞生長到對數生長期后，制備細胞懸液，在紫外交聯儀中，于254 nm波長下照射30 min，將細胞濃度調整為1×107備用。按下列配方制備3種佐劑瘤苗，瘤苗A：黃芩素（50 mg/kg）+滅活的B16F10細胞；瘤苗 B：黃芩素（100 mg/kg）+滅活的 B16F10細胞；瘤苗C：弗氏完全佐劑+滅活的B16F10細胞；瘤苗D：制備不加佐劑的滅活的B16F10細胞；E組為50 mg/kg的黃芩素，F組為100 mg/kg的黃芩素，G組為單獨的弗氏完全佐劑作為對照，H組不做任何處理。其中C組為陽性對照，將配制后的瘤苗于4℃保存備用。

1.2.3 佐劑瘤苗的注射與黑色素瘤模型的建立將A-H 8種佐劑瘤苗分別通過肌肉注射的方式對小鼠進行免疫一次，14 d后，同樣的劑量強化免疫一次，再 7 d 后，通過皮下注射 B16F10（1×106/ml）腫瘤細胞構建腫瘤模型，每只小鼠注射量為100μl。待小鼠腫瘤達到20 mm時處死，提取脾臟中的淋巴細胞。

1.2.4 脾臟中淋巴細胞的提取 （1）小鼠經斷頸處死，將小鼠置于75%乙醇溶液中15 min。（2）在超凈臺中分離小鼠脾臟，收集脾臟細胞。（3）2000 rpm離心2 min后棄去上清液，之后加入700μl裂解物裂解RBC 2 min，加入700μl完全培養基使裂解終止。 （4）以 2000 rpm 離心 2 min后，棄廢液。 （5）用PBS液體清洗2次后即得到淋巴細胞。

1.2.5 流式細胞儀檢測不同濃度的黃芩素對CD4+T細胞的刺激活性 將每組小鼠的淋巴細胞制成懸液，鋪于96孔板中，每孔 2×106/ml，于含有5%CO2的37℃細胞培養箱中培養12 h，棄掉培養基，每孔加100μl 4%多聚甲醛溶液，之后用PBS清洗兩次，用0.1%的 tritionX-100將抗體PE anti-mouse IL-2和PE anti-mouse TNF-α稀釋并染色，于4℃避光1 h，用BD Accuri C6 software流式細胞儀進行檢測。

1.2.6 流式細胞儀檢測不同濃度黃芩素對CD8+T細胞的刺激活性 將每組小鼠的淋巴細胞制成懸液，鋪于 96 孔板，每孔 2×106/ml，于含有 5%CO2的37℃細胞培養箱中12 h后，棄掉培養基，每孔加100μl 4%多聚甲醛溶液，之后用PBS清洗兩次，用0.1%的 tritionX-100將抗體PE anti-mouse IFN-γ和 PE anti-mouse TNF-α 稀釋并染色，tritionX-100用于破膜，于4℃避光1 h，用BD Accuri C6 software流式細胞儀進行檢測。

1.2.7 細胞毒性實驗 將每組小鼠淋巴細胞濃度調節至1×107/ml，在細胞懸液中加入CFSE儲存液（終濃度 1μM）1μl，立即混合，室溫下暗染 15 min，加入1/2體積的胎牛血清終止反應。 此時，細胞是效應細胞。用生長對數期的小鼠黑色素瘤B16F10細胞制備細胞懸液，并用1μmol/LCFSE標記，立即混勻，置于37℃細胞培養箱中避光染色15 min作為靶細胞，在96孔板中，每孔加入50μl 1×105/ml靶細胞用和50μl效應細胞 （效靶比為1.7∶1至45∶1）。 混勻后在37℃5%CO2下培養6 h后用BD Accuri C6 software流式細胞儀進行檢測。

1.2.8 細胞增殖測定 通過CCK-8測定評估T細胞增殖能力，將來自荷瘤小鼠脾臟的冷凍細胞復蘇并鋪于96孔板，每孔100μl，在含有5%CO2的37℃細胞培養箱中培養4～6 h后，每孔加入103個滅活的B16F10細胞作為實驗組，每孔加入10μl PMA+Ionomycin（10 μg/ml）作為陽性對照組，沒有處理組（H組）作為陰性對照；在抗原刺激24 h、48 h和72 h后，在96孔板中加入10μl的CCK-8溶液，再置于含有5%CO2的37℃細胞培養箱中培養2 h后，用酶標儀在254 nm波長下檢測OD值。

1.2.9 腫瘤生長的評估 在可測量（4～5 mm）腫瘤生長后，用游標卡尺每隔1 d測量腫瘤生長，并記錄最大縱向直徑和最大橫向直徑。通過以下公式計算腫瘤大小：面積=π/4（長×寬）。當腫瘤大小達到平均直徑約20～25 mm時，處死小鼠并評估每組小鼠的生存率。

1.3 統計學分析 所有的數據都是采用 （x±s）表示。采用t檢驗法比較各組之間的差異，不同組之間的比較采用two-way ANOVA檢驗。所有的統計分析都是采用GraphPad Prism 5和BD Accuri C6 Software軟件進行分析，ns代表差異無統計學意義（P＞0.05）；＊為差異顯著（P＜0.05）；＊＊為差異非常顯著（P＜0.01）。

2 結果

2.1 不同濃度的黃芩素對CD4+T細胞的刺激活性抗原特異性T細胞的功能可以通過上調細胞因子表達能力來表示。通過檢測CD4+T細胞內的細胞因子IL-2和TNF-α的表達水平來檢測CD4+T的活性。與只注射抗原組（D組）相比，A組中IL-2的表達明顯升高，而B組和C組，無明顯差異；與只注射抗原組（D組）相比，A組和B組中的TNF-α的表達差異顯著，但表達水平略低于CFA加抗原組（C組）（如圖 1）。

圖1 注射瘤苗A、B、C的實驗組和D、E、F、G、H對照組的CD4+T細胞的細胞因子的表達情況

2.2 不同濃度的黃芩素對CD8+T細胞的刺激活性通過檢測CD8+T細胞的細胞因子IFN-γ和TNF-α的表達情況來檢測CD8+T的活性。與只注射抗原組（D組）相比，A組和B組中IFN-γ的表達差異顯著，但較C組有所降低；與只注射抗原組（D組）相比，A組中的TNF-α的表達無明顯差異，B組和C組中的TNF-α的表達差異顯著，綜上所述，B組即100 mg/kg的黃芩素+滅活的B16F10細胞組的作用效果較明顯（如圖2）。

圖2 注射瘤苗A、B、C的實驗組和D、E、F、G、H的對照組的CD4+T細胞的細胞因子的表達情況

2.3 不同濃度的黃芩素對T細胞的細胞毒性測試和增殖的影響 在細胞毒性試驗中，如圖3A所示，與只注射抗原組（D組）相比，A組和B組中的CTL顯著增加。CCK-8增殖實驗結果顯示，與只注射抗原組（D組）相比，在72 h后，A組和B組中的細胞毒性T淋巴細胞（CTL）顯著增加（圖3B）。這些結果表明黃芩素能夠提高T細胞的殺傷力并促進T細胞增殖。

2.4 腫瘤生長的評估 在造模成功后，通過公式計算腫瘤的面積，如圖4A，與D組相比較，B組的腫瘤較小。同時計算了每組小鼠的死亡率，如圖4B，與D組相比較，B組小鼠的生存率較高。

圖3 體內細胞毒性測試和細胞增殖測定的結果

圖4 造模后，每組小鼠的腫瘤大小和生存率情況

3 討論

癌癥生物學的一個目標是消除癌細胞對免疫系統的逃逸。免疫應答的特異性使得其具有極高的吸引力，幾十年的研究已經導致了這一平臺的顯著改進。首先在體外和體內的一系列研究中證明了T細胞介導抗癌作用的能力［22］。在黑色素瘤的治療方面，手術切除是目前最直接的方法，但創傷較大，并不能預防其發生。佐劑是用于感染性疾病和癌癥疫苗的重要組分，因為它們可以進一步促進免疫應答。目前針對腫瘤的佐劑效果不是很好，大部分都具有不良反應，因此，可以通過開發具有佐劑活性的全新化合物和通過優化佐劑制劑來開發更有效的癌癥疫苗佐劑。黃芩素是我國傳統中藥，在該研究中，將中藥與現代技術相結合，檢測黃芩素是否具有佐劑的作用。

該研究將不同濃度的黃芩素（50 mg/kg、100 mg/kg）與滅活的黑色素瘤細胞混合作為實驗組，以弗式完全佐劑與滅活的腫瘤抗原作為陽性對照對小鼠進行免疫，之后皮下接種黑色素瘤細胞，通過對小鼠腫瘤的大小、小鼠的生存率及小鼠脾臟中T淋巴細胞內的細胞因子檢測來確定黃芩素的作用，實驗結果顯示，100 mg/kg的黃芩素作用效果較好，與陰性對照相比，小鼠的存活率明顯升高，并且能夠使CD4+T細胞的細胞因子IL-2和TNF-α有不同程度的表達上調，使CD8+T細胞的細胞因子TNF-α和IFN-γ表達量增加。該研究通過黃芩素對T細胞的細胞因子的表達情況來觀察其對T細胞的影響功能，為黑色素瘤疫苗佐劑的研究添磚加瓦。