Rho激酶抑制劑聯合神經生長因子促進脊髓損傷后神經再生的實驗研究

董春霞，金 善

神經生長因子（NGF）廣泛存在于神經系統中，屬于神經調節因子之一，對神經細胞的生長、分化、存活、再生和功能維護等多方面具有調控作用；同時對于受損傷的神經，可以發揮營養和促進修復及再生的作用。研究發現髓鞘源性抑制分子可以激活Rho激酶活性，而NGF可以對此過程產生明顯的抑制作用，因此能夠在上游途徑阻斷Rho/Rho激酶信號通路［1，2］；Fasudil屬于 Rho 激酶的抑制劑，可以從下游途徑對Rho/Rho激酶信號通路進行阻斷。因此NGF聯合Rho激酶抑制劑能夠在上下游途徑同時阻斷Rho/Rho激酶信號通路，從而最大程度地促進神經修復和再生。目前針對脊髓損傷的情況，尚未有機構將二者聯合應用進行研究。該研究選擇應用Fasudil聯合神經生長因子進行治療，目的在于研究二者聯合應用對大鼠脊髓損傷神經再生的促進作用。

1 材料與方法

1.1 基礎資料及分組方式 該次研究共選擇40只清潔級健康的雌性SD大鼠，體重均在250～300 g。按照隨機分組的方式分成四組，每組10只，具體分為對照組，Fasudil治療組，NGF治療組和Fasudil+NGF聯合治療組四組。其中Fasudil治療組在對大鼠進行脊髓橫斷后，立即給予腹腔注射Fasudil Hydrochloride 5 mg/kg，1次/d，同時采用微量注射泵以3μl/h的速度經蛛網膜下腔持續注射生理鹽水20μl/d，連續注射4 W；NGF治療組每只大鼠經微量注射泵以3μl/h的速度持續蛛網膜下腔注射NGF20 μl（60 μg）/d，同時腹腔注射生理鹽水（與Fasudil Hydrochloride同體積）1次/d，連續4 W；Fasudil+NGF聯合組同時腹腔注射Fasudil Hydrochloride 5 mg/kg，1次/d及微量注射泵蛛網膜下腔注射 NGF 3 μl/h，20 μl（60 μg）/d，連續 4 W；對照組腹腔及蛛網膜下腔注射等量生理鹽水。

1.2 主要試劑 多聚甲醛 （上海化學試劑廠），Mouse Anti-Tau1抗體 （美國 Millipore公司），SABC-Cy3試劑盒 （武漢博士德生物工程有限公司），Fasudil Hydrochloride（天津紅日藥業有限公司），注射用鼠神經生長因子（武漢海特生物制藥股份有限公司）。

1.3 儀器 眼科維納斯剪（江蘇六六視覺科技股份有限公司），手術顯微鏡（上海醫療儀器廠），微量注射泵（來普LP210型），MDF-32V超低溫冰箱（日本SANYO），恒冷箱切片機（德國Leica公司），熒光顯微鏡（奧林巴斯BX51），多聚賴氨酸載玻片（上海桑戈生物科技有限公司）。

1.4 方 法

1.4.1 模型制備 使用10%的水合氯醛對大鼠進行腹腔注射麻醉，按照0.4 g/kg給藥劑量注射；待麻醉起效后，將大鼠取俯臥四肢外展體位固定于手術臺上。該次研究脊髓損傷位置均選擇在T10節段，根據T9～T11的骨性標志進行查找定位，然后對手術區進行備皮、消毒并鋪設無菌洞巾。在手術區域沿棘突做一約4 cm長的縱行切口，分層切開皮膚和淺筋膜，然后進行軟組織分離，至T7～T9椎板暴露；將T8的椎板和棘突咬除，并注意盡量減少對周圍脂肪組織的撕扯，以防由于椎管內靜脈叢破裂而導致大出血。然后在顯微鏡下進行操作，將椎管和硬膜囊充分暴露出來，并剪開硬膜囊，應用眼科維納斯剪跨過脊髓背側中線將脊髓后3/4剪斷，深度約為1.5 mm（該次研究所選大鼠的脊髓深度約在2 mm左右）；并用棉片對受傷位置輕壓止血，利用前期分離出的軟組織進行創口填塞，從而達到減少腦脊液外漏及隔絕外界炎性物質刺激的作用，防止對脊髓繼續造成損傷；同時在創口撒上青霉素粉劑，按照組織分層，從肌肉到皮下、皮膚逐層進行縫合。對于假手術組所有過程與橫斷組相同，但不進行脊髓切斷。

1.4.2 大鼠蛛網膜下腔置管 大鼠橫斷模型制備成功后暫不完全縫合創口，于T10節段處蛛網膜下腔內插入硬膜外導管，導管與椎旁軟組織及皮膚固定，另一端露于皮膚外，石蠟封口，注射藥物時與微量注射泵連接。

1.4.3 術后護理 由于脊髓神經損傷，術后大鼠體溫調節功能嚴重失調，出現體溫偏低的情況，所以術后應將飼養環境中的溫度保持在25～28℃，同時注意通風問題。術后預防性給予青霉素40萬U，肌肉注射1次/d，連續給藥7 d；同時為防止出現水電解質紊亂給予生理鹽水10 ml/d，腹腔注射，連續給藥7 d；另外術后7 d內給予含有呋喃坦啶的飲用水以防止和減輕尿路系統感染；術后應加強飲食營養支持，可給予適量餅干。術后實驗大鼠分籠飼養，避免互相影響，墊料需要每日定時更換；同時為了避免大鼠術后出現下肢水腫和壓瘡，應每日進行患肢按摩，并對下肢周圍皮膚進行清洗和干燥。術后1～2 W大鼠可以恢復自主排尿功能，在此之前應通過按摩和擠壓膀胱輔助進行排尿2次/d。

1.4.4 運動功能評價 采用 BBB（Basso，Beattie，and Bresnahan）Locomotor Rating Scale［3］運動功能評分法對大鼠的后肢運動功能進行評價，評價采用實驗操作者以外的雙人、雙盲獨立評價方式，最后按照平均值進行評分。具體標準如下：0分：后肢完全未能運動。1分：1或2個關節可以進行輕微運動，多數為膝或踝關節。2分：存在1個可以進行廣泛運動的關節，可同時伴或不伴有另1個可輕微運動的關節。3分：存在2個可以進行廣泛運動的關節。4分：3個關節均可以進行輕微運動。5分：2個可輕微運動的關節和第3個可進行廣泛運動的關節。6分：2個可進行廣泛運動的關節和第3個可輕微運動的關節。7分：3個關節均可以進行廣泛運動。8分：無負重狀態下可以進行運動或足底踏地。9分：只有在靜止狀態下可以進行負重足底踏地，或者頻繁甚至持續的足背踏地。10分：負重足底步態偶爾發生，但與前肢運動并不協調。11分：負重足底步態頻繁或持續，但與前肢運動并不協調。12分：負重足底步態頻繁或持續，與前肢運動偶爾協調。13分：負重足底步態頻繁或持續，與前肢運動協調較為頻繁。14分：持續存在負重足底步態，且與前肢運動協調狀態持續存在；在剛抬腿和剛接觸地面時姿勢以內旋或外旋為主，呈現出頻繁的足底步態，前后肢運動持續協調，偶見足背步態。15分：持續存在負重足底步態，且與前肢運動協調狀態持續存在；前肢向前運動時未見或偶見趾尖交替踏地，爪子初次接觸地面時爪位與身體方向相同且較有力量。16分：持續存在負重足底步態，且與前肢運動協調狀態持續存在；前肢向前運動時趾尖交替踏地較頻繁，當爪子初次接觸地面時，及立足姿勢在結束抬爪之前，爪位與身體方向相同且較有力。17分：足底步態和與前肢相協調的運動持續存在，前肢向前運動時趾尖交替踏地頻繁，在落爪和抬爪時，爪位與身體方向相同且較有力。18分：足底步態和與前肢運動協調狀態持續存在，前肢向前運動時趾尖交替踏地頻繁，在落爪和抬爪時，爪位與身體方向相同且十分有力。19分：足底步態和與前肢相協調的運動持續存在，前肢向前運動時趾尖交替踏地頻繁，在落爪和抬爪時，爪位與身體平行，且積極有力，大鼠尾部始終保持下垂狀態。20分：足底步態和與前肢相協調的運動持續存在，前肢向前運動時趾尖交替踏地頻繁，在落爪和抬爪時，爪位與身體平行且有力，大鼠尾部持續抬起狀態，軀干穩定性差。21分：連續的足底步態，且步態協調，腳尖持續踏地，整個過程爪位有力且與身體平行，尾部持續抬起狀態，且軀干穩定。

特別說明：（1）足底步態是指足底與地面接觸以支持自身體重，且后肢積極進行向前方運動時足底能夠再次與地面接觸并支持體重。（2）足背步態是指在行走的過程中，足背的某個部位發揮支持體重的作用。

1.5 脊髓組織切片制備 每次評分結束后，在四組大鼠內各隨機抽取5只，將右心耳剪開，然后經左心室插管到升主動脈內，首先灌注500 ml 37℃的生理鹽水，然后快速灌注250 ml 4%的多聚甲醛（pH7.4），當大鼠全身抽搐時需要首尾拉直并減緩灌注速度；1 h內再次灌注250 ml的多聚甲醛，此時大鼠出現全身僵硬。完成灌注后，在脊髓橫斷上下位置各0.5 cm處取1 cm長度的損傷段脊髓，置于4%的多聚甲醛內進行固定，時間為6 h，然后進行脫水處理、石蠟包埋，恒冷切片機內切片，矢狀位切片厚6μm，并貼于防脫載玻片上，晾干后-20℃保存。最后應用SABC法進行RhoA和ROCK2免疫組織化學染色。

1.6 免疫熒光染色（Tau1）方法 具體操作如下：（1）將冰凍切片在室溫環境下放置1 h，然后置入0.01mol PBS 中清洗 3 次，10min/次；（2）滴加 0.01mol PBS1∶10稀釋的正常血清封閉液，室溫10 min，除去多余液體；（3）滴加 0.01 mol PBS1∶500 稀釋的小鼠抗 Tau1 一抗，37 ℃ 2 h；（4）0.01 mol PBS 洗滌2 min×3 次；（5） 滴加 0.01 mol PBS1∶100 稀釋的生物素化抗小鼠 IgG，37 ℃ 30 min；（6）0.01 mol PBS洗滌 2 min×3 次；（7） 滴加 1∶100 稀釋的 SABCCy3，37 ℃ 30 min；（8）0.01 mol PBS 洗滌 5 min×3次；（9）1∶1 甘油 PBS 封固。

1.7 統計學方法 實驗數據以 （x±s）表示，采用SPSS 10.0統計軟件進行完全隨機設計的方差分析，兩組之間比較行Dunnett t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

該次研究成模的40只大鼠，在4 W觀察期內，4只大鼠死亡，其中2只死于體重過低，另2只死于皮膚感染，已根據各組的條件死亡時及時給予補充。

2.1 大鼠BBB評分對比 Fasudil治療組、NGF治療組和對照組大鼠術后3 d BBB評分為0分，Fasudil+NGF聯合組術后3 d有部分大鼠開始出現后肢輕微運動；術后 7 d、14 d及 28 d時間點Fasudil+NGF聯合組、Fasudil治療組和NGF治療組BBB評分均較對照組明顯升高（P＜0.05）；術后各時間點Fasudil+NGF聯合組BBB評分均較Fasudil治療組和NGF治療組升高，差異有顯著性意義 （P＜0.05）。 見表 1、圖 1。

2.2 免疫熒光染色結果 Tau1為軸突標志物，陽性纖維顯示為紅色熒光，用image軟件測量陽性纖維的截面積。4 W時對照組損傷段脊髓組織內陽性纖維數量極少；NGF治療組陽性纖維較對照組增加，但排列紊亂；Fasudil治療組陽性纖維也較對照組明顯增加，且部分陽性纖維連續性增強；Fasudil+NGF聯合組陽性纖維數量較其他三組均明顯增加，連續性也明顯增強，如表2所示具有顯著性差異（P＜0.05）。相應運動功能評價見圖2。

表1 各組大鼠不同時間點BBB評分，分）

表1 各組大鼠不同時間點BBB評分，分）

注：與 Fasudil組、NGF 組比較，＊P＜0.05；與 Fasudil組、NGF 組和 Fasudil+NGF 組比較，▲P＜0.05。

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表2 各組大鼠4周時免疫熒光染色陽性纖維截面積（mm2）

圖1 術后不同時點運動功能

圖2 4 W時免疫熒光染色結果

3 討論

當中樞神經系統（CNS）出現損傷時，局部可發生較為復雜的生理和病理變化，同時存在著多種抑制神經再生的因素，例如局部神經營養因子的缺乏或濃度過低，以及損傷局部出現再生抑制蛋白以及在損傷區形成膠質瘢痕等情況，均不利于神經的修復和再生。Rho/ROCK信號通路的主要生理功能為調節細胞骨架蛋白的合成、降解、移動和收縮等，并參與細胞的遷移、增殖和存活等基本生命過程［4，5］。大量研究顯示，Rho/Rho激酶信號通路對損傷脊髓的神經修復和再生具有很強的抑制作用，起到關鍵作用；因此阻斷該信號通路將有助于促進損傷后的神經再生。神經再生過程主要分為三個階段：軸突芽生、再生軸突的生長和延伸、恢復神經支配原靶器官。研究發現Rho激酶抑制劑Fasudil能夠改善脊髓損傷后的運動功能，促進軸突再生，減輕繼發性損傷［6］。神經生長因子（NGF）廣泛存在于各機體神經系統中，屬于神經調節因子之一，對神經細胞的生長、分化、存活、再生和功能維護等多方面具有調控作用；同時對于受損傷的神經，NGF可以發揮營養和促進修復及再生的作用。對其生物學效應進行分析，主要包括以下四個方面：（1）NGF具有較強的促進神經再生作用，可以直接對再生軸突發揮作用，通過受體介導細胞內進行信號轉導，激活周圍各種分化因子，有效發揮神經趨化作用，從而引導軸突生長并加快生長速度；并通過促進雪旺細胞的增殖分化，吞噬、清除細胞殘渣，為神經元的重生提供空間，神經膜細胞同時可以產生髓磷脂對神經軸突進行包繞，恢復超微結構，從而為神經傳導恢復打下堅實的基礎。（2）NGF具有促進神經芽生的作用。（3）NGF對炎性反應趨化作用和再生神經的血管形成均有促進作用。通過以上分析可見，NGF可以有效促進中樞和外周神經元的生長、發育、分化、成熟，既能夠維持神經系統的正常功能，又可以加快神經系統損傷后的修復［2］。同時NGF對已經出現損傷的神經元的基因表達發揮調控作用，抑制細胞凋亡，降低受損神經細胞的死亡率，具有抑制凋亡速度的作用，從而降低神經元的損傷程度。可能的作用機制包括：（1）NGF可以有效促進生長相關蛋白 43mRNA （growth-associated protein，GAP-43 mRNA）的合成；（2）NGF能促進突觸素p38mRNA的表達；（3）對毒性氨基酸的釋放具有顯著的抑制作用；（4）對超氧自由基的釋放和鈣離子的超載也有顯著的抑制作用［7，8］。脊髓損傷后外源性NGF能夠發揮神經再生修復作用，但對損傷局部再生仍然存在著抑制作用，從而使NGF不能發揮促神經再生的最佳效果，如果在給予外源性促神經生長因子的同時阻斷微環境中抑制神經再生的關鍵信號傳導通路，即Rho/Rho激酶信號通路，就可以最大程度地發揮促進損傷神經的修復和再生作用。目前針對脊髓損傷的情況，尚未有將二者聯合應用進行的研究。本研究針對大鼠脊髓損傷情況，選擇應用Fasudil聯合神經生長因子進行治療，采用BBB評分及微管相關蛋白Tau1免疫熒光染色法觀察聯合應用對損傷后軸突再生及運動功能的改善作用，結果顯示兩者聯合應用有協同效應，能在更大程度上促進軸突再生及改善運動功能。

鹽酸法舒地爾（fasudil hydrochloride）注射液，屬于ROCK抑制劑，可以通過競爭ROCK催化內的ATP結合位點，發揮競爭性拮抗作用，從而阻斷ROCK活性，達到抑制Rho/Rho激酶信號通路下段的作用［9］。在Rho/Rho激酶信號通路被阻斷后，對于可以導致生長錐形成塌陷的髓鞘源性的再生抑制分子，包括Nogo2A、MAG和Omgp等的傳導受到抑制，從而使得損傷后的軸突可以繼續進行修復和再生［10］。外源性NGF的應用補充了損傷環境中神經營養因子的缺乏，同時近年來的研究還發現中樞神經系統的髓鞘源性再生抑制分子（Nogo2A、MAG和Omgp等）與NGF之間存在一個共同的低親和力受體，即p75NTR，所以通過給予外源性NGF，增加中樞神經系統局部NGF的濃度，從而大量與p75NTR發生結合，達到競爭性抑制Nogo2A、MAG和Omgp等與受體的結合，從而抑制其對 Rho 的激活［1，2］。 由此可見NGF能夠在Rho/Rho激酶信號通路的上游途徑發揮抑制作用，但由于p75NTR只是NGF的低親和受體［2］，因此可能這種抑制作用并不完全。NGF與Fasudil聯合應用后，前者部分阻斷了Rho/Rho激酶信號通路的上游途徑，后者阻斷了下游途徑，兩者共同作用下在更大程度上抑制了Rho/Rho激酶信號通路的傳導，而此時NGF在再生抑制機制被阻斷的前提下能夠更有效地發揮其促神經再生的作用，因此NGF與Fasudil的聯合應用在更大程度上促進了脊髓損傷后的軸突再生和相應的神經功能恢復。該次研究結果顯示，聯合應用Fasudil+NGF組的大鼠術后3 d時BBB評分明顯高于對照組與單獨應用Fasudil治療和NGF治療組的大鼠（P＜0.05），同時Fasudil+NGF聯合用藥組的大鼠多數在術后3 d已經開始出現后肢輕微運動；之后各時間點的比較，Fasudil+NGF聯合組的BBB評分也均高于其他三組，由此可以印證，采用Fasudil和NGF聯合用藥，分別對Rho/Rho激酶信號通路的上游和下游進行阻斷，達到徹底阻斷的作用。另外免疫熒光染色結果顯示，Fasudil和NGF聯合應用后，軸突陽性纖維數量更多且排列整齊，連續性更強，也說明二者聯合用藥對神經的再生具有很好的促進作用。

綜上所述，聯合應用Fasudil與NGF可以有效促進受損脊髓神經修復和再生，軸突纖維再生增多且連續性強，可以有效改善運動功能，兩者聯合應用將為脊髓損傷的藥物治療提供新的思路。