IL-10啟動子基因多態性與腦梗死相關性分析

袁 磊，杜敢琴

腦梗死是個體長期功能障礙的主要原因之一，降低患者的獨立性和生活質量。非特異性炎癥在缺血/再灌注損傷中的作用已經得到闡明，并且既往研究已經證明其在腦梗死急性期發揮關鍵作用[1-2]。腦缺血誘導強烈的免疫應答和炎癥反應，其特征在于活化的細胞因子、趨化因子、黏附分子和加劇組織損傷的蛋白水解酶等。白介素-10(interleukin-10，IL-10)是一種多效性細胞因子，可在腦缺血損傷過程中發揮抗炎作用[1]。IL-10基因啟動子高度多態，具有多個單核苷酸多態性位點。最重要的3個位點是-1082A/G、-819C/T和-592C/A。白介素-10(IL-10)缺乏會加劇炎癥并惡化腦缺血。鑒于IL-10基因啟動子區域中單核苷酸多態性位點-1082A/G和-819C/T的作用，本研究重點關注IL-10基因啟動子多態性與腦梗死之間的關系，采用擴增突變系統—聚合酶鏈反應(ARMS-PCR)檢測腦梗死患者-1082A/G和-819C/T的分布頻率[2]，研究結果支持IL-10 A等位基因決定了腦梗死遺傳易感性的觀點，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2016年7月至2017年7月河南省南陽市第二人民醫院神經內科收治的急性腦梗死患者154例，納入標準：①年齡18～80歲；②發病24 h內就診；③符合《中國急性缺血腦卒中診治指南2015》中急性腦梗死的診斷標準[3]；④病因經頭顱MRA或CTA證實為動脈粥樣硬化。對照組126例，納入標準：①年齡18～80歲；②既往無腦梗死病史；③無腦梗死臨床表現，查體無腦梗死體征；④頭顱CT或MRI排除腦梗死。兩組排除標準：①短暫性腦缺血發作；②伴心肌梗死、血管炎、創傷、甲狀腺疾病、血液疾病、使用免疫抑制劑、癌癥、妊娠、自身免疫性疾病、感染、腦血管畸形或動脈瘤[4]；③伴有意識障礙者。該研究經倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2方法收集兩組人口學特征(性別、年齡)、腦梗死高危因素(高血壓、糖尿病、冠心病、心房纖顫等病史)，并對兩組分別利用擴增突變系統—聚合酶鏈反應方法進行等位基因多態性分型，見表1。

表1 IL-10-1082A/G和-819C/T基因座位引物

1.3基因組DNA的提取將兩組空腹肘靜脈血樣品置于EDTA-Na抗凝管中。根據DNA提取試劑盒(Promega Corporation，Madison，WI，USA)的說明進行基因組DNA提取。 DNA工作溶液的最終濃度為0.1 g·L-1，工作溶液儲存在-20 ℃。

1.4IL-10啟動子多態性檢測基因測試引物由上海生物工程技術公司(中國上海)合成。根據先前描述的方法進行PCR擴增(MBI Fermentas，上海)。 IL-10-1082A/G和-819C/T基因座位引物見表1。基因多態性通過ARMS 進行基因分型。每25 μL工作溶液中含有25～50 ng基因組DNA，0.25 mM特異性引物和0.1 mM內部對照引物，1.5 mM MgCl2，0.2 mM每種dNTP，500 mM KCl，200 mM Tris-HCl，0.001%明膠和0.5 U Taq DNA聚合酶。內部參考引物用于鑒定成功的PCR擴增，并擴增HLA-DRB1基因的外顯子3的保守區域。擴增IL-10-1082G/A和-819C/T等位基因的ARMS-PCR：95 ℃下1 min變性進行擴增，然后95 ℃下10個循環15 s，65 ℃ 50 s，72 ℃ 40 s，以及95 ℃ 20 s，59 ℃ 50 s和72 ℃ 30 s的20個循環，然后冷卻至4 ℃。PCR擴增后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物。天源測序生物技術有限公司(中國北京)對兩組基因譜帶進行測序。258 bp處的電泳帶代表純合子等位基因，即G(GG)或A(AA)。 使用相同的兩對引物，另一個258 bp的電泳帶代表雜合子等位基因(AG)，見圖1。

圖1 基因分型電泳圖譜為白介素(IL)-10啟動子區-1082位點

1.5統計學方法采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，等位基因頻率計算為：(2×純合子+雜合子)/(2×患者數)。使用Hardy-Weinberg平衡法分

析每組的代表性樣品。分類數據[n(%)]通過卡方檢驗進行分析。以正態分布為特征的測量數據(平均值±SD)通過雙樣本t檢驗分析。采用多變量logistic回歸分析法篩選腦梗死的高危因素，并計算優勢比(odds ratio,OR)和95%可信區間(confidence interval,CI)。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1單因素分析觀察組和對照組性別、年齡及高血壓、冠心病、糖尿病、腦卒中病史、心房顫動發生率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2；觀察組高同型半胱氨酸、顱內動脈狹窄高于對照組，兩組IL-10-1082A/G基因型分布頻率差異有統計學意義(P<0.05)。對于IL-10-1082位點，觀察組A等位基因頻率92.21%顯著高于對照組的85.32%，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表2 兩組臨床基線資料比較

注：①與對照組比較，P<0.05。

表3 兩組白介素-10-1082A/G和-819C/T等位基因頻率比較 例(%)

注：①與對照組比較，P<0.05。

2.2多因素分析將單變量分析中有統計學差異的變量進行多因素logistic回歸分析，高同型半胱氨酸(有=1，無=0)、將空腹血糖(實測值)、顱內動脈狹窄(有=1，無=0)、入院后血壓降低(有=1，無=0)、IL10-1082位點A基因型(有=1，無=0)作為自變量，以急性腦梗死(有=1，無=0)為因變量進行多因素logistic回歸分析，結果表明，IL10-1082位點AA基因型、高同型半胱氨酸是急性腦梗死發生的獨立危險因素(P<0.05)，見表4。

表4 腦梗死高危因素的多因素logistic回歸分析

3 討論

缺血性腦損傷的發病機制是復雜的，由促炎細胞因子和趨化因子以及其他炎性介質介導的非特異性炎癥在其中發揮重要作用[5]。IL-10可以防止缺血腦組織中抗凋亡蛋白Bcl-2的下調，并且通過激活素依賴機制限制對腦的興奮毒性損傷[6]。IL-10的保護機制是通過下調IL-1β、腫瘤壞死因子α、P-選擇素和其他促炎細胞因子的表達，并減少神經細胞凋亡來實現的[7]。研究顯示P-選擇素、IL-6啟動子多態性和腦梗死之間有密切關聯[8]。這些發現表明IL-10有助于減少局灶性腦缺血后的梗死體積和促進神經改善。

IL-10基因啟動子區大約5 kb，位于翻譯起始位點上游。IL-10基因啟動子高度多態，具有多個單核苷酸多態性位點[9]。最重要的3個是IL-10-1082A/G、IL-10-819C/T和IL-10-592C/A。本研究發現中國漢族人群中IL-10-1082位點G等位基因攜帶者的頻率顯著低于愛爾蘭、墨西哥和其他種族。此外，本數據顯示IL-10-1082基因座GG基因型在中國漢族群體中是不可檢測的，并且僅存在AA和/或AG基因型。這些發現表明，某些炎性細胞因子的基因多態性根據種族而不同[10]。以上研究證明單核苷酸多態性位點IL-10-819和IL-10-592處的遺傳連鎖是相關的[11]。研究表明IL-10基因多態性與漢族人群血清脂蛋白水平之間的關系。與AA基因型相比，IL-10-1082GA基因型攜帶者的HDL濃度較高，TG水平較低。既往研究表明，IL-10啟動子區-1082位的多態性可能影響血清HDL和TG濃度，而該基因的其他突變體似乎與血清脂蛋白水平無關[12]。

IL-10基因啟動子多態性與體內IL-10表達水平密切相關。研究表明，與IL-10-1082A、-819T和-592A相比，IL-10-1082G、-819C和-592C是高度表達的等位基因。在等位基因IL-10-1082A存在時，用刀豆蛋白A刺激淋巴細胞導致比等位基因-1082A陰性細胞更低的IL-10產生[13]。研究還發現蛋白質產量不依賴于等位基因IL-10-819和-592，表明IL-10水平主要由-1082基因型決定。本研究提示AA基因型腦梗死風險比AG基因型高2倍(OR=2.031,95%CI：1.134～3.637)。因此，AA基因型是腦梗死的獨立危險因素。本研究結果顯示腦梗死患者中A等位基因頻率(92.2%)高于正常對照組(85.7%)。這在IL-10-819C/T和-592C/A基因型分布和等位基因頻率中沒有[14]，表明腦梗死的發病率與IL-10-1082A/G等位基因密切相關[15]。

本研究發現IL-10-1082基因多態性與腦梗死顯著相關，腦梗死易感基因的檢測有利于鑒別疾病風險人群，提高療效。