乙酰化TLR4在GDM孕婦外周血單核細胞中的表達及意義

周愛芬

(許昌市立醫(yī)院婦產科，河南 許昌 461000)

近年來妊娠期糖尿病 （gestational diabetes mellitus，GDM）的發(fā)病率一直處于高位并常伴有多項并發(fā)癥，嚴重威脅了母嬰的身體健康，故而，研究GDM的相關機制對其早期診斷并給予恰當的治療具有重要意義，也是目前臨床研究的重要方向[1]。現階段的研究[2]認為GDM的主要病因是胰島素抵抗(insulin resistant，IR)和胰島功能受損。研究[3]已證實GDM孕婦體內抗炎-致炎失衡、慢性炎癥狀態(tài)和 Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)途徑等參與了IR和胰島功能受損的形成過程并認為TLR4過度表達導致的機體異常炎癥反應狀態(tài)已成為多項炎癥性疾病的病理基礎。

先前的研究[4]發(fā)現內毒素(lipopo-lysaccharide，LPS)-Toll樣受體4(TLR4)-核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路激活誘發(fā)炎癥因子分泌和釋放可能參與了GDM的發(fā)病過程，蛋白質乙酰化在調控蛋白質功能上具有簡單的開關作用，屬于一種動態(tài)可逆的翻譯后修飾。但現階段關于乙酰化TLR4在GDM體內是否表達并發(fā)揮一定作用尚不明晰。故此，本研究深入探討了乙酰化TLR4在GDM孕婦外周血單核細胞中的表達及在LPSTLR4-NF-κB通路中的作用，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2017年10月在我院治療的GDM孕婦67例（GDM組），納入標準：⑴診斷符合國際妊娠合并糖尿病研究組（IADPSG）制定的標準；⑵孕周在24～28周；⑶年齡＜35歲；⑷孕婦及家屬知情同意。排除標準：⑴非單胎妊娠；⑵合并有感染、妊娠期高血壓、妊娠期肝內膽汁淤積癥、肝腎功能損害等疾病。同時選取健康孕婦67例作為對照組，GDM組和對照組孕婦年齡、孕周比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組孕婦一般資料比較

1.2 實驗方法 采用Western blot法檢測TLR4、乙酰化TLR4和NF-κB p65蛋白表達：冰上裂解細胞，分別離心后取上清置于EP管中，提取總蛋白后，取20ug總蛋白行SDS-PAGE電泳，常規(guī)轉膜后5%脫脂奶粉2h室溫封閉，分別加入適量對應抗體，孵育（4℃）一抗過夜，洗滌后二抗孵育，ECL發(fā)光試劑盒曝光顯影。

微板法檢測血清脂多糖（LPS）：陰性對照管加入100ul細菌內毒素檢查水，待檢管加入100ul內毒素標準溶液，供試品管加入100ul供試品，三管均加入100ul鱟試劑后混勻，37℃孵育10min，各加入100ul顯色基質溶液，混勻后37℃孵育6min，各管均加入500ul偶氮試劑1溶液，混勻后各管均加入500ul偶氮試劑2溶液，混勻靜置后酶標儀檢測吸光度[5]。

ELISA法檢測腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）和白細胞介素-10（IL-10），試劑盒購于南京建成生物研究所，實驗操作嚴格按照說明書進行。

1.3 統計學處理 統計分析采用SPSS 19.0軟件，計量資料采用（±s）表示，兩組間比較使用t檢驗，相關性采用Pearson相關分析，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組TLR4及乙酰化TLR4表達比較 GDM組和對照組TLR4蛋白相對表達差異比較無統計學意義（P＞0.05）；GDM組檢測到乙酰化TLR4相對表達，而對照組未檢測到乙酰化TLR4表達。見表2。

表2 兩組TLR4及乙酰化TLR4表達比較

2.2 兩組 LPS、TNF-α、IL-1及 IL-10比較 GDM組 LPS、TNF-α、IL-1 及 IL-10 明顯高于對照組（P＜0.05），見表 3。

表3 兩組LPS、TNF-α、IL-1及IL-10比較

2.3 兩組 NF-κB p65表達比較 GDM 組 NF-κB p65蛋白相對表達明顯高于對照組（P＜0.05），見表4。

2.4 相關分析 將GDM組乙酰化TLR4相對表達與 LPS、TNF-α、IL-1、IL-10 及 NF-κB p65 蛋白相對表達進行Pearson相關分析，結果顯示乙酰化TLR4 相對表達與 LPS、TNF-α、IL-1、IL-10 及 NF-κB p65蛋白相對表達呈正相關 （r=0.321、0.304、0.335、0.341 和 0.482，P＜0.05）。

表4 兩組NF-κB p65表達比較

3 討論

GDM是于妊娠期診斷的糖耐量減低和糖尿病的總和，研究發(fā)現本病可伴發(fā)多項并發(fā)癥，經資料[6，7]分析總結其對孕婦的影響主要包括；早期胚胎發(fā)育異常、感染、流產，甚至死亡，羊水過多、妊娠期高血壓疾病、分娩后代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）的發(fā)生風險增加等；其對胎兒及新生兒的影響主要包括：胎兒生長受限 （fetal growth restriction，FGR）、巨大胎兒、新生兒低血糖、畸形及呼吸窘迫綜合征等病癥。

研究[8]認為GDM的主要病因是胰島素受損和胰島素抵抗，而孕婦體內炎癥狀態(tài)與兩者的發(fā)生、發(fā)展關系密切。TLR4可誘發(fā)多種免疫炎癥反應并已成為多種炎癥疾病的重要生理、病理基礎。資料[9]顯示乙酰化是蛋白質重要的翻譯后修飾過程，可調控不同的細胞質過程，并與細胞核存在重要作用，單核細胞內TLR4 mRNA表達的增加也促進了GDM的發(fā)生。Xu C[10]的研究發(fā)現TLR4蛋白是炎癥通路活化的必要條件，其在翻譯后可被乙酰化進而促進炎癥因子的表達。LPS-TLR4-NF-κB通路屬于重要的TLR4信號通路，已成為GDM發(fā)病機制的重要方向[11]。Zhang Y[12]通過對炎癥因子表達與 TLR4、NF-κB mRNA的相關性分析證實LPS-TLR4-NF-κB通路的激活與GDM關系密切。但現階段關于TLR4乙酰化在GDM體內是否表達及作用機制尚不明晰。故此，本研究深入探討了乙酰化TLR4在GDM孕婦外周血單核細胞中的表達及在LPS-TLR4-NF-κB通路中的作用。

GDM組和對照組TLR4蛋白相對表達差異比較無統計學意義（P＞0.05）；GDM組TLR4乙酰化相對表達為（1.012±0.062），而對照組未檢測到乙酰化TLR4表達，差異比較有統計學意義（P＜0.05）。上述結果說明GDM患者存在乙酰化TLR4的過度表達，并提示TLR4乙酰化可作為GDM患者早期診斷和預后評估的重要指標。

GDM 組 LPS、TNF-α、IL-1 及 IL-10 分別為（0.95 ±0.11）IU/ml、 （56.01 ±3.18）pg/ml、 （76.82 ±3.05）pg/ml和（32.17±4.07）pg/ml，明顯高于對照組（P＜0.05）；GDM 組 NF-κB p65 蛋白相對表達為（0.763±0.073），明顯高于對照組（P＜0.05）。 因妊娠期孕婦體內環(huán)境可出現適應性改變，患者腸道菌群可導致LPS異位進入外周循環(huán)，可誘導多種細胞的TLR4活化及獨立誘導機體產生IR外，將炎癥通路激活[13]。故而，GDM 患者 LPS、TNF-α、IL-1及IL-10水平高于對照組。筆者推測LPS可能通過提高乙酰化TLR4進而活化炎癥通路，加速炎癥因子的表達。此外，IL-10的升高幅度相對低于TNF-α和IL-1，說明GDM孕婦體內低度炎癥狀態(tài)可能通過增加乙酰化TLR4的敏感性從而加劇了抗炎-致炎的失衡[14]。

GDM組TLR4乙酰化相對表達與LPS、TNF-α、IL-1、IL-10及 NF-κB p65蛋白相對表達呈正相關（P＜0.05）。上述結果說明了TLR4通過翻譯后的乙酰化修飾作用調控著孕婦體內LPS-TLR4-NF-κB 通路的活化程度。 LPS、TNF-α、IL-1、IL-10 升高可導致胰島功能的損傷和IR的形成。IL-1、IL-10即是作為體內重要的抗炎細胞因子并能抑制NF-κB，發(fā)揮抑制炎性細胞分泌炎性因子的作用[15]。此外，筆者認為在研究妊娠期糖尿病的發(fā)病機制時，還要考慮妊娠這一特殊生理條件對妊娠期糖尿病的影響，妊娠期間特殊的內分泌和代謝變化是妊娠期糖尿病發(fā)生的重要因素。但本研究存在一定缺陷，本研究僅在體外環(huán)境下進行，然而人體內的復雜環(huán)境是否對乙酰化TLR4修飾產生影響，仍需要大樣本研究證實。

綜上所述，GDM孕婦外周血單核細胞存在乙酰化TLR4，其與炎癥因子水平有一定相關性，值得進一步研究。