淫羊藿-仙茅藥對有效成分在骨髓炎兔體內的藥動學研究*

王娜妮 許平翠 張 揚 壽 旦

浙江省中醫藥研究院 浙江 杭州 310007

骨髓炎具有病程長、反復發作、易致殘等特點，是骨科復雜病種。淫羊藿-仙茅是常用治療骨病的溫補腎陽藥對，能促進成骨細胞生長，修復骨缺損。本研究采用骨髓炎兔模型，研究淫羊藿和仙茅配伍前后有效成分的體內藥動學行為變化，探討藥對配伍協同增效的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：雄性新西蘭兔，3月齡，體質量為2.2±0.1kg，浙江省實驗動物中心提供。動物質量合格證號：SYXK（浙）2017-0009。

1.2 藥品：淫羊藿、仙茅飲片購自華東醫藥公司，經浙江省中醫藥研究院俞忠明副主任中藥師鑒定為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicomu Maxim.的干燥葉和石蒜科植物仙茅Curculigo orchioides Gaertn.的干燥根莖。對照品淫羊藿苷（純度≥98%，批號：489-32-7）、朝藿定A（純度≥98%，批號：MUST-12062311）、朝藿定B（純度≥98%，批號：MUST-12062312）、朝藿定C（純度≥98%，批號：MUST-12062313）、仙茅苷（純度≥98%，批號：85643-19-2）、苔黑酚葡萄糖苷（純度≥98%，批號：15072213）均購自北京世紀奧科生物技術有限公司。

1.3 試劑與儀器：甲醇、乙腈均為色譜純（德國Merk公司）；生理鹽水（批號：A16032301）購自浙江科倫制藥有限公司。其他試劑均為分析純。Xevo TQD超高效液相色譜-三重四級桿質譜儀（美國Waters）；Smart2Pure UV/UF超純水儀（美國Thermal fisher）；AE240電子天平（瑞士Mettler）；Microfuge 20R離心機（美國Beckman coulter）；Lab dancer S25渦旋振蕩混合器（德國Ika）。

1.4 藥對及單味藥材提取物的制備：取淫羊藿、仙茅各10g，混合，加藥材重量20倍量的水，煎煮1h，濾過，藥渣加20倍量的水，煎煮1h，濾過，合并2次煎煮液，濃縮至生藥含量為淫羊藿和仙茅各1.5g/ml的水提液。取淫羊藿、仙茅藥材各10g，分別單煎，加水量、煎煮次數及方法同藥對水提液制備方法，制備生藥含量均為1.5g/ml的淫羊藿水提液及仙茅水提液。

1.5 骨髓炎兔模型制備及分組：參照課題組前期已建立的造模方法[1]，進行造模手術，術后4周驗證模型。造模成功的骨髓炎兔隨機分為：模型組、淫羊藿組、仙茅組、藥對組，每組3只。

1.6 給藥及血漿制備：除模型組外，其余各組采用清創手術-局部抗炎-灌胃給藥治療方案：按50mg/只的萬古霉素給藥劑量，病灶局部置入載萬古霉素硫酸鈣。淫羊藿組給予6g/kg/d淫羊藿提取液，仙茅組給予6g/kg/d仙茅提取液，藥對組給予6g/kg/d淫羊藿+6g/kg/d仙茅的藥對提取液。另取正常動物設空白對照組。給藥前12h禁食，自由飲水，給藥后8h統一禁食。連續灌胃給藥5d。第5d灌胃后，分別在后0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、2.0、3.0、4.0、8.0、10.0、20.0、30.0h，兔耳緣靜脈取血0.3ml，將血液置入裝有肝素鈉抗凝的離心管中，4℃下5000rpm迅速離心10min，取上清液即為含藥血漿。

1.7 血漿藥物濃度檢測：分述如下。

1.7.1 血漿樣品預處理：精密量取血漿100μl，加入500μl乙腈漩渦混勻，5000rpm離心10min，上清液氮氣吹干，100μl流動相[0.1%甲酸乙腈（A)∶0.1%甲酸水溶液（B)=24∶76（v/v)]復溶，12000rpm離心10min，取上清液待色譜分析。

1.7.2 對照品溶液的配制：分別精密稱取6種對照品適量，分別用乙腈溶解配置為質量濃度為1mg/ml的母液，4℃冰箱保存備用。使用前分別精密吸取一定量的對照品母液，用流動相[0.1%甲酸乙腈（A）∶0.1%甲酸水溶液（B）=24∶76（v/v）]稀釋成質量濃度分別為 0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00μg/ml的對照品溶液。

1.7.3 液相色譜條件：Capcell C18色譜柱（250.0mm×4.6mm，5μm），柱溫30℃，進樣量10μl，流速1.0ml/min。

流動相為0.1%甲酸乙腈（A）∶0.1%甲酸水溶液（B)=24∶76（v/v)，檢測波長270nm。

1.8 統計學方法：采用SPSS17.0統計軟件進行統計分析，實驗數據用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 色譜分析和方法學考察：取7份100μl空白血漿，加入不同質量濃度的100μl混標溶液，按1.7.1項下方法操作，在1.7.3項下條件測定，結果見圖1。6個主要有效成分線性范圍均為0.0100-10.0000μg/ml，回歸方程和相關系數（r）：苔黑酚葡萄苷：Y=0.0018X+0.0025，r=0.9993；仙茅苷：Y=0.0716X+0.0025，r=0.9994；朝藿定A：Y=0.2345X+0.0041，r=0.9993；朝藿定B：Y=0.2634X+0.0350，r=0.9997；朝藿定 C：Y=0.1611X+0.0625，r=0.9999；淫羊藿苷：Y=0.0356X-0.0201，r=0.9998。該方法的日內和日間精密度RSD（n=6）均小于5%，血漿經冷藏（－80℃、3d）和反復凍融（3次）后各成分RSD（n=3）均小于10%，平均加樣回收率均在85%～105%之間，符合檢測要求。

2.2 藥動學參數計算和分析：淫羊藿和仙茅配伍前后給藥各成分在骨髓炎兔體內的血藥濃度-時間曲線見圖2。血藥濃度數據采用藥動學計算軟件3p97擬合，采用非房室模型計算藥動學參數，灌胃淫羊藿仙茅水提物后，各有效成分在骨髓炎兔體內的藥動學參數見表1。

圖1 淫羊藿仙茅藥對主要有效成分HPLC色譜圖

圖2 淫羊藿仙茅藥對給藥后各成分的藥時曲線

表1 淫羊藿和仙茅配伍前后淫羊藿苷和仙茅苷的藥動學參數比較

3 討論

骨髓炎合并有死骨形成、成骨活性下降、局部血液循環差等問題，是病灶清除后骨缺損難以修復的重要原因。有研究發現抗生素植入技術結合淫羊藿、仙茅口服給藥有較強的抗感染能力和較好的成骨活性，能在病灶徹底清除后，有效發揮骨修復作用。中藥配伍可以影響有效成分在體內的吸收和代謝。淫羊藿和仙茅均可溫補腎陽，相須為用，相得益彰。本實驗研究了淫羊藿仙茅配伍前后6種主要有效成分朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、苔黑酚葡萄糖苷、仙茅苷在骨髓炎兔體內的藥動學行為，發現配伍顯著影響其在骨髓炎兔體內的藥動學行為，使其血藥濃度增加，體內清除速率減慢，生物利用度增加，從而促進藥物進入病變部位，延長藥物在體內的滯留時間，發揮協同增效作用。從藥動學角度闡明了仙茅和淫羊藿配伍治療骨髓炎骨不連的合理性。