補(bǔ)腎益髓方促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞向M2極化的作用

孫 豪 鄭 宏 計(jì) 婧 李 明 趙 暉 張秋霞 齊 放 李君玲 樊永平 王 蕾*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中醫(yī)臨床方藥學(xué)系 中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院中醫(yī)科，北京 100070)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)炎性脫髓鞘病變?yōu)橹饕攸c(diǎn)的自身免疫性疾病[1]。在MS的病理過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞向M1極化，分泌促炎因子等造成炎性脫髓鞘[2]，M2細(xì)胞減少，導(dǎo)致其抗炎、吞噬髓鞘碎片和促進(jìn)髓鞘再生等能力不足，使疾病慢性進(jìn)展，最終演變成神經(jīng)退行性病變[3]。因此，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2型相對平衡，是緩解MS的重要措施之一[4]。

研究[5]顯示，M1型細(xì)胞特異性表達(dá)CD86，M2型細(xì)胞特異性表達(dá)Arg-1，以此作為鑒別M1、M2型的標(biāo)志物。過氧化物酶體增生物激活受體-γ(peroxisome proliferator activated receptor,-γ PPAR-γ)是一種細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞分型的因子[6]。PPAR-γ表達(dá)升高時，會促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化，同時抑制小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型極化[7]。

研究[8-9]顯示，補(bǔ)腎益髓方(Bu Shen Yi Sui Formula，BSYS)可以顯著緩解MS及其動物模型EAE發(fā)病，具有神經(jīng)保護(hù)作用，但其作用機(jī)制仍不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，采用實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠模型，觀察BSYS對EAE小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，并利用免疫熒光法檢測小鼠腦和脊髓中小膠質(zhì)細(xì)胞CD86、Arg-1的表達(dá)，Western blotting法觀察PPAR-γ的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法測定抗炎因子干擾素-β(interferon-β，INF-β)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的表達(dá)，以進(jìn)一步探究本方對EAE小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞極化狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雌性C57BL/6小鼠，6 ～8周齡，體質(zhì)量15 ～ 17 g，購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(軍)2012-0004，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心國家標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室許可證號：SYXK(京)2015-0012，溫度 18～22 ℃，相對濕度40%～60%，自由飲食和飲水。所有實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)動物福利委員會審查批準(zhǔn)。

1.2 藥物和試劑

BSYS (生地黃、熟地黃、制何首烏、酒大黃、益母草、浙貝母、水蛭、全蝎、天麻、連翹)由北京亞東生物制藥有限公司制備。醋酸潑尼松片(prednisone acetate，PA)由天津力生制藥有限公司生產(chǎn)。髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(myelin oligodendroglia glycoprotein，MOG35-55)由北京旭和源生物科技有限公司合成；滅活結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis，H37Ra，MTB，批號：4283842，購自美國BD公司)；完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA，批號：SLBH7316V，購自美國Sigma公司)；百日咳毒素(pertussis toxin，PTX，批號：SLBP1591V，購自美國Sigma公司)；CD86抗體(貨號：ab119857)、Arg-1抗體(ab91279)、PPAR-γ抗體(ab209350)均購自英國Abcam公司；INF-β試劑盒(KE1415)、TGF-β1(KE1420)試劑盒均購自美國Immunoway公司。

1.3 分組及模型制備

80只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對照組(normal control group，NC)，模型組(model group，MO)，激素組(prednisone acetate group，PA)及BSYS組，每組各20只。各造模組在免疫開始及第7天于小鼠背部中線兩側(cè)皮下4點(diǎn)注射抗原0.2 mL，由100 μL 0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液將按1∶1混合的MOG35-55與CFA稀釋，含50 μg MOG35-55，100 μL CFA和0.3 mg MTB，且免疫開始及48 h后，腹腔注射PTX 500 ng/只，誘導(dǎo)小鼠EAE模型。NC組小鼠用等體積 0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液代替[10]。

1.4 給藥和處理方法

免疫當(dāng)天開始分別給予小鼠灌胃，PA組PA劑量為5 mg/kg，BSYS組為生藥3.02 g/kg，NC組和MO組均灌服相同體積蒸餾水。每天1次，連續(xù)40 d，發(fā)病后每天觀察小鼠神經(jīng)行為學(xué)變化，于發(fā)病急性期(第23天)、緩解期(第40天)取腦和脊髓。

1.5 組織標(biāo)本采集及處理

在發(fā)病第20天和第40天，每組取4只小鼠給予10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水合氯醛(190 mg/kg)腹腔注射麻醉，4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛心臟灌流，取腦和脊髓。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，以2 μm厚度連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色，光鏡觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 小鼠神經(jīng)行為學(xué)

小鼠發(fā)病后，每天由2名研究者共同對小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分。神經(jīng)功能評分采用15分記分法：尾巴活動分為3級：無癥狀者0分，尾巴張力降低或尾巴遠(yuǎn)端癱瘓1分，尾巴全癱2分；肢體活動分為4級：無癥狀者0分，步態(tài)不穩(wěn)1分，肢體輕癱，行走時肢體拖拽2分，肢體全癱，行走時肢體外翻3分。分?jǐn)?shù)累積得出總分。若出現(xiàn)死亡則記為15分[11]。

1.6.2 病理學(xué)觀察

光鏡下觀察HE染色腦與脊髓的病理改變。炎性細(xì)胞浸潤評分方法如下。0分：未見炎細(xì)胞浸潤；1分：可見散在分布的少數(shù)炎性細(xì)胞；2分：血管周圍有少量炎性細(xì)胞聚集；3分：血管周圍有大量炎性細(xì)胞聚集；4分：炎性細(xì)胞浸潤伴有血管套形成，或彌漫性的炎性細(xì)胞浸潤。

1.6.3 免疫熒光(immunofluorescence,IF)染色觀察

小鼠腦及脊髓切片，脫蠟至水化，檸檬酸緩沖液300 ℃修復(fù)20 min，冷卻至室溫。10%(體積分?jǐn)?shù))羊血清封閉37 ℃，60 min。滴加CD68(1∶100)/Arg-1(1∶100)一抗稀釋液，4 ℃孵育48 h。取出后37 ℃復(fù)溫，60 min。避光加入熒光標(biāo)記的二抗稀釋液(1∶200)。37 ℃孵育60 min。DAPI封片，4 ℃保存。應(yīng)用Leica TCS SP5激光共聚焦顯微鏡下觀察。隨機(jī)選取每個腦和脊髓切片5個視野進(jìn)行圖像統(tǒng)計(jì)分析。

1.6.4 Western blotting法檢測

取小鼠腦組織，按1∶7的比例加入裂解液，勻漿后，冰上放置30 min，4 ℃條件下離心20 min，取上清液。每孔加上清液100 μL，將96孔板置于37 ℃，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行檢測。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本濃度，稀釋使其終濃度為3 g/L。取蛋白樣品7 μL進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜40 min，5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗稀釋液PPAR-γ(1∶1 000)/GAPDH(1∶20 000)，4 ℃過夜。洗膜5 min×4次，加入二抗稀釋液(1∶20 000，抗兔/小鼠)，室溫孵育1 h，洗膜5 min×4次，滴加ECL進(jìn)行曝光。Image J處理圖片，并讀取條帶的吸光度值，半定量分析各組蛋白的表達(dá)量。

1.6.5 ELISA法檢測

提取各組小鼠腦組織中蛋白，每孔加上清液100 μL，將96孔板置于37 ℃，反應(yīng)120 min后，按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行檢測。用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本濃度。ELISA試劑盒于室溫平衡20 min，嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行操作。酶標(biāo)儀測定450 nm處A值，以A值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組炎性反應(yīng)因子相應(yīng)濃度，結(jié)果以ng/L表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 BSYS對EAE小鼠神經(jīng)功能評分的影響

小鼠發(fā)病后，表現(xiàn)為精神萎靡，皮毛不光滑，活動減少，并出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，表現(xiàn)為尾部無力拖垂，步履蹣跚，后肢癱瘓，進(jìn)而發(fā)展為四肢癱瘓，甚至死亡。各造模組小鼠自造模后第13天陸續(xù)發(fā)病，神經(jīng)功能評分呈現(xiàn)不同程度升高。MO組小鼠評分于第22天達(dá)高峰，峰值為5.9分，PA組與BSYS組評分明顯低于MO組(P<0.01)。隨后各組的評分逐漸下降，變化趨勢相同，治療組較MO組均有意義(P<0.05)。第25天至第40天各組趨于平緩，病情趨于平穩(wěn)，但未恢復(fù)正常，各治療組病情較MO組均明顯減輕，詳見圖1。

圖1 各組小鼠神經(jīng)功能評分變化Fig.1 Changes of neurological function score ineach groups of mice#P<0.05 vs MO group, **P<0.01 vs NC group;MO:model; PA:prednison acetate; BSYS:Bu Shen Yi Sui Formula; NC:normal control.

2.2 BSYS對EAE小鼠腦和脊髓組織病理變化的影響

第23天時，NC組小鼠腦組織，著色均勻，結(jié)構(gòu)有序完整。MO組腦白質(zhì)血管周圍有炎細(xì)胞浸潤，核固縮明顯，呈明顯的“袖套樣”改變。PA、BSYS組腦白質(zhì)血管周圍有炎細(xì)胞浸潤，部分核固縮，嚴(yán)重程度較MO組低。第40天時，各造模組病理表現(xiàn)和第23天比較，均有明顯的減輕(P<0.05)，且PA、BSYS組嚴(yán)重程度較MO組低。炎性細(xì)胞浸潤評分結(jié)果顯示，第23和第40天，PA組與BSYS組較MO組評分明顯降低(P<0.05，P<0.01)。詳見圖2、3，表1。

2.3 BSYS對EAE小鼠腦及脊髓組織中CD86、Arg-1的影響

發(fā)病后第40天時，各組CD86、Arg-1的表達(dá)有明顯差異，其中MO組CD86表達(dá)較NC組上調(diào)(P<0.05)，PA組及BSYS組CD86表達(dá)較MO組有不同程度下調(diào)(P<0.05)。MO組Arg-1表達(dá)較NC組下降(P<0.05)，PA組和BSYS組Arg-1表達(dá)較MO組有不同程度上升(P<0.05),脊髓組織變化與腦組織相似，詳見圖4、5，表2、3。

圖2 不同時間各組小鼠腦組織病理學(xué)變化Fig.2 Pathological changes in brain tissue of mice in each groups at different times (HE staining,400×)A，B：normal control group；C，D：model group；E，F(xiàn)：prednisone acetate group；G，H：Bu Shen Yi Sui Formula group.

圖3 不同時間各組小鼠脊髓組織病理學(xué)變化Fig.3 Pathological changes of spinal cord tissue in mice of each groups at different times(HE staining,400×)A，B：normal control group；C,D：model group；E,F：prednisone acetate group；G,H：Bu Shen Yi Sui Formula group.

表1 各組小鼠腦及脊髓中病理學(xué)評分的變化Tab.1 Changes in pathological scores in brain and spinal cord of mice of each group

圖4 各組小鼠第40天腦組織CD86表達(dá)Fig.4 CD86 expression in brain tissue of mice in each group on day 40NC:normal control; MO:model; PA:prednison acetate; BSYS:Bu Shen Yi Sui Formula.

圖5 各組小鼠第40天腦組織Arg-1表達(dá)Fig.5 Arg-1 expression in brain tissue of mice in each group on day 40NC:normal control; MO:model; PA:prednison acetate; BSYS:Bu Shen Yi Sui Formula.

2.4 BSYS對EAE小鼠腦組織中PPAR-γ的影響

Western blotting檢測結(jié)果顯示，第23天和第40天，各組PPAR-γ蛋白表達(dá)有明顯差異。MO組PPAR-γ蛋白表達(dá)較NC組明顯升高(P=0.000)。與MO組比較，各治療組PPAR-γ蛋白表達(dá)均顯著升高(P=0.000)，詳見表4，圖6。

表2 各組小鼠第40天腦組織中CD86、Arg-1的相對表達(dá)Tab.2 Protein expression of CD86 and Arg-1 in brain tissue of mice in each group on day 40

**P<0.01vsNC group，#P<0.05vsMO group.NC:normal control;MO:model;PA:prednison acetate;BSYS:Bu Shen Yi Sui Formula.

表3 各組小鼠第40天脊髓組織中CD86、Arg-1蛋白的相對表達(dá)Tab.3 Protein expression of CD86 and Arg-1 in spinal cord tissue of mice in each group on day 40

*P<0.05，**P<0.01vsNC group；#P<0.05，##P<0.01vsMO group.NC:normal control;MO:model;PA:prednison acetate;BSYS:Bu Shen Yi Sui Formula.

圖6 各組小鼠腦組織中PPAR-γ蛋白表達(dá)Fig.6 PPAR-γ protein expression in brain tissue of mice in each groupPPAR-γ:peroxisome proliferator activated receptor-γ;NC:normal control; MO:model; PA:prednison acetate; BSYS:Bu Shen Yi Sui Formula.

2.5 BSYS對EAE小鼠腦組織中INF-β、TGF-β1相對表達(dá)的影響

第23天和第40天，各組INF-β與TGF-β1相對表達(dá)有明顯變化。與NC組相比，MO組腦組織中INF-β、TGF-β1相對表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。與MO組相比，各治療組可顯著上調(diào)腦組織中INF-β、TGF-β1相對表達(dá)(P<0.05)，詳見表5。

表4 各組小鼠腦組織中PPAR-γ蛋白的相對表達(dá)Tab.4 PPAR-γ protein expression in brain tissue of each group of mice

***P=0.000vsNC group,###P=0.000vsMO group;PPAR-γ:peroxisome proliferator activated receptor-γ;NC:normal control;MO:model;PA:prednison acetate;BSYS:Bu Shen Yi Sui Formula.

表5 各組小鼠腦組織中INF-β、TGF-β1相對表達(dá)Tab.5 Relative content of INF-β and TGF-β1 in brain tissue of each group of mice

3 討論

本研究結(jié)果顯示，BSYS能降低EAE小鼠神經(jīng)功能評分，改善EAE癥狀，并且能明顯降低EAE急性期及緩解期的炎性細(xì)胞浸潤，緩解炎性反應(yīng)，說明BSYS具有神經(jīng)保護(hù)作用和一定的抗炎作用，與課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符[12-13]。

小膠質(zhì)細(xì)胞在介導(dǎo)EAE/MS發(fā)病及修復(fù)中發(fā)揮著重要的作用[14]。在急性期時，大量小膠質(zhì)細(xì)胞活化并向M1型極化，M1型推動著EAE早期疾病的進(jìn)程。一方面發(fā)揮著抗原遞呈作用，促進(jìn)T細(xì)胞的活化及毒溶解作用[15]；另一方面釋放腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等促炎因子，可形成炎性反應(yīng)級聯(lián)，造成髓鞘脫失，損傷神經(jīng)組織[16]。研究[17]顯示，M2型細(xì)胞能分泌抗炎因子如IFN-β、TGF-β1。INF-β是由病毒及微生物等干擾素誘生劑誘導(dǎo)細(xì)胞后產(chǎn)生的高活性多功能蛋白，具有極強(qiáng)的抗病毒活性。有研究[18]顯示M2型分泌產(chǎn)生的IFN-β與髓鞘碎片吞噬密切相關(guān)，用IFN-β處理的未成熟小膠質(zhì)細(xì)胞，可以改善脫髓鞘培養(yǎng)模型中髓鞘碎屑的清除水平。TGF-β1是一種多功能蛋白質(zhì)，通過激活細(xì)胞表面的受體，影響細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)等功能[19]。但由于MS/EAE緩解期時慢性炎性反應(yīng)的刺激，炎性反應(yīng)因子水平并沒有降低，M2型數(shù)量卻比M1型少，對受損碎片的吞噬作用不強(qiáng)，損傷的神經(jīng)組織沒有得到修復(fù)[14，20]。可見，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2極化是緩解及治療MS的關(guān)鍵。

PPAR-γ是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，為核受體超家族中的成員之一，能夠調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的分型，且與M2型密切相關(guān)[21]。促進(jìn)PPAR-γ蛋白的表達(dá)，可促使小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化[22]。PPAR-γ在EAE中也具有重要作用，有研究[23]顯示，PPAR-γ的激動劑能調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的成熟和分化，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生NO及促炎因子白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、TNF-α等來減輕EAE癥狀。亦有相關(guān)報道[18-19]，中藥如人參皂苷類等可上調(diào)動物模型體內(nèi)PPAR-γ水平，激活PPAR-γ相關(guān)信號通路，抑制炎性反應(yīng)[24-25]。臨床上使用的PPAR-γ激動劑羅格列酮和布洛芬均能下調(diào)EAE動物模型中TNF-α mRNA的表達(dá)，說明PPAR-γ激動劑對EAE模型的神經(jīng)保護(hù)作用[26]。

本研究結(jié)果顯示，在急性期及緩解期時，BSYS可以上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞中Arg-1的表達(dá)，同時下調(diào)CD86的表達(dá)，使二者比值趨近平衡。其機(jī)制可能與BSYS方激活了PPAR-γ相關(guān)信號通路，打開了小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化的分子開關(guān)有關(guān)，使得M2型細(xì)胞比例增多，分泌更多IFN-β、TGF-β1等抗炎因子，減輕組織周圍炎性反應(yīng)，有利于神經(jīng)組織和脫髓鞘的修復(fù)。

綜上所述，BSYS能夠改善EAE癥狀，緩解炎性反應(yīng)，促進(jìn)受損神經(jīng)組織及髓鞘的修復(fù)，這為BSYS在臨床上治療MS提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。但其調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化的相關(guān)通路的分子機(jī)制研究尚未十分明確，還有待深入探究。