陳皮、半夏對動脈粥樣硬化小鼠PI3K-Akt通路、SOD、MDA、SA-β-gal水平的影響

孫亞男 黃小波 粱 偉 陳文強

(首都醫科大學宣武醫院中醫科，北京 100053)

衰老引起的血管老化在動脈粥樣硬化中具有重要作用。血管內皮細胞凋亡是動脈粥樣硬化發生的一個始動環節。PI3K-Akt是誘導血管內皮細胞凋亡的關鍵通路，在動脈粥樣硬化病理過程中起著重要的作用。中醫認為水谷精微由清化濁，變生痰濁，留滯脈絡之中，凝聚成塊，是動脈粥樣硬化發生的重要因素。而陳皮、半夏作為化痰對藥，為多數化痰復方的核心組成藥物，有化痰祛濕的功效。本課題組前期研究[1]證明其可以有效抑制動脈粥樣硬化的發生。Klotho敲除小鼠是一種基因缺陷小鼠，有著衰老、動脈硬化等特征。因此在本研究中使用陳皮、半夏對動脈粥樣硬化動物模型進行干預，研究陳皮、半夏是否通過調控PI3K-Akt通路、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和β-半乳糖苷酶(senescence-associated beta-galactosidase,SA-β-gal)而干預動脈粥樣硬化的發生。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級Klotho敲除小鼠40只，C57BL/6小鼠10只，雄性，體質量30～50 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK(京)2016-0006。所有動物飲水不限，自由攝食，光/暗各12 h。

1.2 陳皮、半夏湯制備

參照本課題組[1]前期研究結果，半夏、陳皮按照1∶1 的比例配伍。參照《中華人民共和國藥典》(2010年版)，蒸餾水泡2 h，常法煎煮2次，每次40 min，濾出，60 ℃恒溫箱內24 h，水浴蒸發，調整濃度至1 g/mL(相當于生藥1 g/mL)。并對pH值、衛生學、比重等進行檢測。4℃儲存備用，用前搖勻。

1.3 血清制備

Klotho敲除小鼠使用陳皮-半夏湯劑灌胃，于末次給藥后1 h麻醉，無菌條件下經腹主動脈采血，室溫放置2 h，3 000 r /min 離心10 min，分離得到血清，56℃滅活30 min，分裝凍存備用。

1.4 方法

1.4.1Klotho敲除小鼠頸動脈檢測

1)實驗動物分組及給藥：采用數字表法將小鼠隨機分為對照組(A組)：C57BL/6小鼠，6周齡(10只)；動脈粥樣硬化衰老模型組(B組)：Klotho敲除小鼠(Klotho-/-)，6周齡(10只)；治療組(C組)：Klotho敲除小鼠，6周齡，陳皮、半夏干預治療(30只)，按照臨床用量的10倍(大劑量，20 g/kg)、5倍(中劑量， 10 g/kg)和、2.5倍(小劑量，5 g/kg)中藥用量，分為3個亞組，每組10只。其中，A組予基礎飼料喂飼；B、C組予高脂飼料喂飼；C組在高脂飼料喂飼基礎上使用陳皮、半夏灌胃給藥，每日給藥1次，連續6周；A、B組使用等體積0.9%(質量分數)氯化鈉注射液灌胃。所有動物飲水不限，自由攝食，光/暗各12 h，每周測體質量一次。使用病理形態學檢測方法抽樣檢驗造模情況。

2)HE染色觀察頸動脈病理改變：Klotho敲除小鼠，取相同部位頸總動脈，置于4%(質量分數，4℃，pH 7.4)的多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋后以4 μm厚度切片，60～62℃烘箱(DHG-9140A型電熱恒溫箱)烤片2 h后行HE染色。每組每個標本隨機選取1張切片，觀察病理改變。

1.4.2 血漿MDA、SOD、SA-β-gal檢測

分離血清，檢測SOD、MDA。SOD活性檢測采用黃嘌呤氧化法，在波長550 nm處比色，按公式計算其活力，SOD活性以每mL反應液中SOD抑制率達50%所對應的SOD量為一個亞硝酸單位。MDA檢測采用硫代巴比妥酸法，在波長532 nm處比色，按公式計算其含量。

檢測頸動脈SA-β-gal。動脈冰凍切片，置于新鮮配制的SA-β-gal孵育液中：X-gal 1 g/L，40 mmol/L檸檬酸緩沖液，pH 6.0、5 mmol/L K4Fe (CN)6、5 mmol/L K3Fe(CN)6、2 mmol/L MgCl2、150 mmol/L NaCl。37 ℃孵箱過夜，顯色，PBS沖洗，10 g/L中性紅復染胞核，油鏡下觀察。

1.4.3 Western blotting法測定頸動脈PI3K與p-Akt表達

RIPA buffer裂解液提取總蛋白，考馬斯亮蘭法測蛋白含量，調整蛋白濃度，煮沸變性5 min，SDS- PAGE 電泳后半干轉印儀轉膜，5%(質量分數)脫脂奶粉的TBST[0.05%(體積分數)的Tween-20]封閉1 h，一抗(兔抗PI3K、兔抗Akt、兔抗p-Akt，1∶1 000)，4 ℃ 孵育過夜，二抗羊抗兔IgG(1∶1 000)孵育1.5 h，β-actin為內對照，洗膜，放射自顯影1 min，定影、晾干、掃描、圖像分析儀對顯影帶分析。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 中藥陳皮、半夏對Klotho敲除小鼠頸動脈病理變化的影響

正常對照組頸動脈血管內膜完整，中膜為梭形平滑肌細胞。模型組有粥樣斑塊形成，內膜明顯增厚，內膜下有大量泡沫細胞堆積。陳皮半夏治療組內膜也有輕度的增生，內膜下有泡沫細胞形成，程度輕于模型組。隨著陳皮半夏用藥劑量的增加，動脈粥樣硬化程度逐漸減輕。表明陳皮半夏對動脈粥樣硬化具有一定的干預作用(圖1)。

2.2 中藥陳皮、半夏對Klotho敲除小鼠血漿MDA、SOD的影響

模型組與對照組的SOD、MDA、SA-β-gal值差異有統計學意義，說明造模成功，詳見表1。

模型組SOD較對照組顯著下降(P<0.01)，MDA和SA-β-gal含量顯著升高(P<0.01)，表明動物在衰老狀態。使用大劑量和中劑量陳皮、半夏干預后，SOD濃度較模型組有顯著上升(P<0.01)，MDA和SA-β-gal含量則顯著降低(P<0.01)，表明中藥陳皮、半夏能夠有效延緩動脈衰老，詳見表2。

圖1 各組小鼠頸動脈的病理變化Fig.1 Pathological changes of carotid artery in mice(HE staining，400×)

表1 對照組與模型組血漿SOD、MDA、頸動脈SA-β-gal含量比較Tab.1 Level of SOD、MDA、SA-β-gal in control group and model group

表2 治療組與模型組血漿SOD、MDA、頸動脈SA-β-gal含量比較Tab.2 Level of SOD、MDA、SA-β-gal in model group and citrus-pinellia group

2.3 中藥陳皮、半夏對Klotho敲除小鼠頸動脈PI3K與p-Akt表達的影響

模型組中，PI3K和p-Akt表達較對照組顯著升高(P<0.01)。陳皮、半夏治療組中各組PI3K和p-Akt表達均較模型組有下降。其中，大劑量和中劑量治療組中PI3K下降水平與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。陳皮、半夏各治療組p-Akt表達均顯著低于模型組，差異有統計學意義(P<0.01)。說明陳皮、半夏對動脈粥樣硬化動物的PI3K和p-Akt水平有較好的調控作用(圖2)。

3 討論

內皮細胞的衰老、凋亡所引起的內皮功能障礙在動脈粥樣硬化的發生、發展過程中起主要作用。血管的氧化應激和內皮細胞功能的障礙加速了血管衰老的進展[2]。在基因缺失的小鼠中，內皮細胞功能出現障礙，提前出現了動脈粥樣硬化，這使小鼠出現了早衰的表現和壽命的縮短[3]。Akt在血管重構的發病機制中起到主要作用，可以通過Akt信號傳導而增加細胞存活，在動脈粥樣硬化中，Akt通過增加血管平滑肌細胞的增生和存活保護內皮細胞[4-5]。

圖2 頸動脈PI3K、Akt和p-Akt表達Fig.2 Expression of PI3K、Akt and p-Akt in carotid artery

△△P<0.01vscontrol group，**P<0.01vsmodel group，1：control group，2：model group，3：citrus-Pinellia high dose，4：citrus-pinellia medium dose，5：citrus-Pinellia low dose.

PI3K/Akt信號轉導途徑是重要的細胞存激酶途徑。PI3K/Akt信號系統廣泛分布于多種細胞中，PI3K 通過對磷脂酰肌醇環上的3位羥基進行磷酸化產生磷酸化的磷脂酰肌醇，并與Akt的PH 區結合，導致Akt從細胞質游離至細胞膜，并且構象發生改變，在Ser473和Thr308位點發生磷酸化，形成信號級聯復合物，然后通過影響下游多種效應分子的活化狀態，而發揮調控內皮細胞凋亡的關鍵作用[6]。PI3K/AKT信號通路可調控細胞增長、增生、粘附等多種生物學功能。PI3K被激活后，可招募并激活AKT，活化的AKT通過磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白的表達，進而調節細胞的增生及凋亡等過程[7]。

MDA升高可以直接反映其遭受了過度的氧化應激損傷，反之則表明受到氧化應激影響的程度減輕。SOD可以清除細胞內活性氧物質，對細胞維持氧化與抗氧化起重要作用。通過檢測細胞內SOD變化可以反映細胞遭受氧化應激的水平[8-10]。已有研究[11-12]證實，細胞內活性氧的增加可引起細胞存活率下降，誘導內皮細胞凋亡，而細胞內活性氧作為重要的細胞內信使，活化AKT、細胞外信號調節激酶等信號轉導通路，直接導致細胞凋亡產生。SA-β-gal是衰老細胞的標志之一，增加自由基的清除并有效抑制過度的氧化修飾可延緩動脈粥樣硬化的進程。目前，已有大量細胞體外實驗[13-14]表明，抗氧化藥物是通過激活PI3K/Akt信號轉導通路，進而上調SOD活性，起到抗氧化應激的作用，有效防治細胞DNA氧化損傷、線粒體功能障礙、神經細胞凋亡等作用。

陳皮、半夏作為臨床常用的化痰對藥，具有燥濕化痰的功效，臨床應用非常廣泛。陳皮長于理氣健脾、燥濕化痰、為脾胃氣滯、胸脘痞滿及痰濕雍滯等常用之品，半夏善于燥濕化痰、降逆止嘔，為痰濕阻滯常用藥。二藥配伍入脾經，半夏得陳皮之氣助則氣順而痰自消，化痰濕之力尤勝；陳皮得半夏之輔，則痰除而氣自下，理氣和胃的功效更顯著[15]。《太平惠民和劑局方》中有二陳湯，可以充分體現二藥合用之功。現有研究[16]表明，半夏和陳皮的主要成分分別是β-谷甾醇和陳皮苷，具有抗炎、抗癌、抗氧化、抗高血脂和防治高血壓等作用。這兩者均能抑制黃嘌呤氧化酶/次黃嘌呤體系中產生的超氧陰離子，其清除自由基的能力在一定濃度范圍內隨著藥物濃度的增大而增強，β谷甾醇和陳皮苷都是良好的抗氧化劑，且能較好地清除自由基，增加細胞內活性氧，從而作用于AKT，進而調節細胞的增生和凋亡[11-12，17-20]。

本研究表明，陳皮、半夏治療能夠有效抑制動脈血管內膜增厚，且隨著劑量的增加抑制逐漸增強，動脈血管內膜增厚的程度逐漸減輕。SOD亦隨著陳皮、半夏劑量的增加而增加，相反，MDA隨其增加而降低，SA-β-gal含量也隨之降低。說明陳皮、半夏可能通過PI3K-Akt通路增加了細胞內活性氧的水平，從而達到控制細胞的凋亡，進而有效抑制動脈粥樣硬化的形成和加重，并且抑制效果與劑量的增加密切相關。

經上述分析，筆者認為陳皮、半夏可能通過PI3K/Akt通路，增加SOD水平，降低MDA、SA-β-gal水平而減少動脈粥樣硬化斑塊形成，從而延緩衰老形成。