陰道微生物菌群與高危型人乳頭瘤病毒16和18型感染的相關性研究

羅 美 何 鑫 劉 軍 張雪芳 張健欣 王秋曦 王淑珍 * 刁小莉 曲久鑫

(1.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院婦產科，北京 100020; 2.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院病理科，北京 100020; 3.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院檢驗科，北京 100020)

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是最常見的性傳播疾病之一，大約1/3的病毒亞型能特定性的感染女性下生殖道鱗狀上皮細胞[1]，其中高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus，HR-HPV)感染是宮頸癌前病變和宮頸癌的危險因素[2]，HPV16和18型是致瘤性最高的亞型，與大約70%的宮頸癌的發生有關[3]。機體的免疫力是HPV獲得與清除的主要影響因素之一，尤其是細胞免疫功能[4-5]。近期研究[6-7]表明陰道微生物菌群與生殖道局部免疫、感染及腫瘤發生有關，可能與HR-HPV感染的獲得及感染狀態有關。但機體陰道微生物菌群的構成與HR-HPV感染的關系，特定的陰道微生物菌群構成是否增加遠期宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和浸潤性宮頸癌的發生，這些問題尚不明確。本研究擬通過對首都醫科大學附屬北京朝陽醫院78例HR-HPV篩查人群的橫斷面研究，明確機體陰道微生物菌群構成與HPV16型和18型感染的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2016年1 月1 日至6 月31 日就診于首都醫科大學附屬北京朝陽醫院婦產科門診的6 680例HR-HPV 檢測女性中，6 152例女性為初次篩查，在初次篩查行HR-HPV 檢測的女性中，陽性患者1 161例，感染率18.87%，HPV16陽性者216例(3.51%)，HPV18陽性者70例(1.14%)，其中共有78例(43例HR-HPV陰性，35例HPV16或HPV18 陽性)女性經知情同意后自愿參加本研究。納入標準：無吸煙史及長期口服避孕藥病史，且人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus， HIV)篩查均陰性的已婚女性，HPV篩查陰性，HPV16型陽性或HPV18型陽性、宮頸脫落細胞學正常或為不典型鱗狀細胞，意義尚不明確 (atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS)。 排除標準：妊娠期，哺乳期，血糖受損或糖尿病患者，既往子宮切除史或宮頸手術史者，接受HPV疫苗注射者，目前活檢或錐切術后病理提示為高級別宮頸上皮內瘤變(CIN2+)或宮頸癌者，既往2年內有異常細胞學(ASCUS陽性)或HPV陽性者，本次宮頸脫落細胞學結果為不能除外高度鱗狀上皮內病變(atypical squamous cells-cannot exclude HSIL，ASC- H)、高度鱗狀上皮內病變(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)、鱗狀細胞癌(squamous of cervical carcinoma，SCC)、不典型腺細胞(atypical glandular cells，AGC)或腺癌者，長期接受免疫抑制劑治療或糖皮質激素類治療的患者。

1.2 研究方案

納入研究人群于月經周期第7～12天于陰道后穹隆處棉拭子采集陰道穹隆分泌物，并保存于-80℃冰箱，進一步行陰道微生物菌群測序，取樣前3 d禁性生活、盆浴及陰道用藥。靜脈血測定HIV、乙丙肝病毒、梅毒感染狀態。采集入組人群基本資料包括年齡、孕產史、性伴侶人數、絕經與否、接觸性陰道出血現象、體質量指數(body mass index，BMI)、HR-HPV感染型別及載量、液基薄層細胞學檢測(thinprep cytologic test, TCT)結果、吸煙史、口服避孕藥情況。

1.3 樣本檢測方法

1.3.1 HPV檢測

采用實時熒光定量聚合酶鏈反應技術(real-time polymerase chain reaction，Rt-PCR)進行HPV 16型、18型核酸測定(試劑盒，上海之江生物科技股份有限公司)，并進一步測定陽性病毒載量水平[8]。

1.3.2 宮頸脫落細胞學診斷標準

采用2001年國際癌癥協會TBS診斷系統：正常(normal)、ASCUS，不典型鱗狀細胞，ASC- H、低度鱗狀上皮內病變(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)、HSIL、SCC、AGC、腺細胞癌。

1.3.3 陰道微生物菌群DNA的提取與測序[9-10]

使用天根DNA提取試劑盒(QIAGEN, Pharma Biotech公司,德國)行陰道棉拭子全基因組提取，PCR技術擴增DNA以及AMPure試劑盒(Agencourt，美國)進一步擴增產物純化，基于Illumina HiSeq測序平臺，利用雙末端測序(Paired-End)的方法，深度測序微生物16SrRNA基因(16S rDNA)的擴增子V4可變區(QIIME測序軟件包及Thermo Fisher Scientific’lon S5XL 測序儀器)。

1.4 判定標準

1.4.1 HPV感染

閾值設定為閾值線超過H2O檢測熒光曲線的最高點，當閾值Ct>40且擴增曲線呈典型S型，則判斷為陽性，否則為陰性。

1.4.2 陰道微生物菌群分類(community state types，CSTs)

CSTsⅠ、Ⅱ、Ⅲ及V分別以卷曲乳酸桿菌、加氏乳酸桿菌、惰性乳酸桿菌和詹士乳酸桿菌為優勢菌，生物多樣性低、相對均勻性；CST Ⅳ的典型特征是乳酸桿菌缺乏、厭氧菌屬豐富，包括加德納菌屬、巨型球菌、普氏菌屬和阿托波屬等。

1.5 統計學方法

應用SPSS 17.0 軟件進行統計學處理，計量資料采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。第一步，Logistic回歸估計CSTs和HPV16/18感染的相關性，由于CSTs是以微生物物種的優勢豐度分類，每個個體均可按此方法歸類為不同的CSTs，因此在判斷不同CSTs與HPV16/18感染的相關性時采用兩種生物統計方法，其中Model A以CST III為參考水平線，分析其他CSTs與CST III相比較，各自同HPV16/18感染的相關性，Model B以剩余CSTs為參考水平線，分析其中一種CSTs和HPV16/18感染的相關性。第二步，主成分分析(Principal Components Analysis，PCA)比較HPV陰性女性和HPV16/18陽性女性陰道微生物菌群構成的多樣性和豐度差異(組間t檢驗)。第三步，LEfSe (LDA Effect Size) 估計女性陰道微生物特殊菌群與HPV16/18感染的相關性。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 納入人群基本特點及陰道微生物菌群特點

1)78例研究對象的基本特點：納入的78例觀察者年齡 23 ～ 66歲，平均年齡(41.28 ±10.32)歲，中位年齡 40歲。對所有觀察者進行長期隨訪，平均隨訪次數為3.81次，中位隨訪時間為16個月(8～26個月)。納入的78例女性研究者中，HPV陰性者43例(55.13%)，HPV陽性者35例(44.87%)，包括HPV16陽性者22例(28.20%)，HPV18 陽性者13例(16.67%)，陽性患者均為單病毒感染。35例HPV陽性的女性平均年齡(41.20±11.63)歲，43例HPV陰性者女性平均年齡(41.35±9.27)歲。入組時初篩HPV16/18陽性和初篩HPV陰性女性在年齡分布、絕經狀態、接觸性陰道出血現象、體質量指數、性伴侶、孕次、產次這些指標上，經χ2檢驗顯示差異均無統計學意義(均P>0.05)。而初篩HPV16/18陽性女性入組時異常細胞學為ASCUS的發生率較初篩HPV陰性女性增加，差異有統計學意義(P=0.002)。詳見表1。

2)78例研究對象的陰道微生物菌群特點：在78例納入研究女性中共發現3種陰道CSTs，最常見的分別是CST III(L.iners) 25例(32.1%)，CST IV (lowLactobacillusspp.) 51例(65.4%)，而CST V(L.jensenii) 僅有2例(2.6%)，且未發現以CSTⅠ(L.crispatus)和CST II(L.gasseri)為優勢菌的人群。圖1 UniFrac analysis顯示了各CSTs物種組成和豐度的差異(P<0.05)，其中CST III和CST V分別以惰性乳酸桿菌和詹氏乳酸桿菌占主要地位，物種多樣性小，相對均勻，而CST IV乳酸桿菌屬缺乏，以厭氧菌屬占主要地位，如無乳鏈球菌、阿托波菌屬、普氏菌屬、孟加氏菌屬等，且物種多樣性顯著增加。CSTs在不同年齡、不同細胞學、絕經與否、接觸性陰道出血、體質量指數、性伴侶、孕產次這些指標上分布差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

2.2 陰道微生物菌群和HPV16/18感染的關系

35例HPV16/18陽性女性陰道微生物菌群CST III(L.iners) 為13例， CST IV (lowLactobacillusspp.) 為21例，CST V(L.jensenii) 1例。χ2檢驗表明CSTs分布與HPV16/18感染與否無關(P>0.05)，進一步回歸分析，Model A和 Model B分析均顯示各CSTs與HPV16/18感染無關，詳見表2。

PCA進一步分析HPV16陽性人群、HPV18陽性人群和HPV陰性人群的陰道微生物菌群構成，圖2 顯示HPV16陽性人群陰道微生物菌群構成顯著不同于HPV陰性人群和HPV18陽性人群，HPV陰性人群和HPV18陽性人群兩者在陰道微生物菌群構成上差異無統計學意義(P>0.05)。

LEfSe分析顯示HPV16感染與HPV陰性人群陰道微生物菌群在無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)構成及豐度上差異有統計學意義，無乳鏈球菌僅發現于HPV16感染者陰道微生物菌群中，可以成為標志性陰道微生物菌群(圖3)。LEfSe分析顯示HPV18感染與HPV陰性人群陰道微生物菌群在乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和厭氧菌屬如阿托波菌屬(Atopobium)、纖毛菌屬(Sneathia)、巨球型菌屬(Megasphaera)構成及豐度上差異有統計學意義，其中HPV18感染者陰道微生物菌群以厚壁菌門(Firmicutes)為主，其中以乳酸桿菌屬(Lactobacillus)為主要豐度，而缺乏厭氧菌屬(圖4)。

表1 研究人群的HPV感染狀態及陰道微生物菌群的類型Tab.1 HPV infection status and types of vaginal microflora in the study population (%)]

*Pearson’sχ2test was used for HPV status,and Fisher’s exact test was used for vaginal bacterial CSTs；CSTs：community state type;HPV:human papilloma virus；ASCUS:atypical squamous cells of undetermined significance;BMI:body mass index.

表2 陰道微生物菌群與HR-HPV感染的相關性分析Tab.2 Correlation between vaginal microflora and HR-HPV infection

*Exact Logistic regression model;OR：Odds ratio;CI：confidence interval；HR-HPV：high risk human papillomavirus；CSTs：community state types.

圖1 UniFrac分析各CSTs物種組成和豐度的差異Fig.1 UniFrac analysis of differences in species composition and abundance of CSTs speciesCSTs：community state types.

3 討論

3.1 高危型HPV感染者陰道微生物構成特點

本研究結果顯示：HPV16/18感染患者與HPV陰性者陰道微生物菌群均以CST IV為主，既往研究[11-12]表明CST IV型主要與細菌性陰道病(bacterial vaginosis,BV)相關，但本研究中所有納入的研究者取樣前均無陰道分泌物顏色及量的改變，無外陰瘙癢等陰道炎及細菌性陰道病的臨床表現，陰道分泌物Nugent評分均排除BV或合并其他陰道炎，表明BV在出現典型臨床表現前已經發生陰道微生物菌群構成的改變，但陰道微生物菌群CST IV型轉變不一定引起典型BV。HPV16/18感染患者與HPV陰性者各CSTs構成比之間差異無統計學意義，表明人群中陰道CSTs分布可能與多種因素相關，其中Ravel等[12-13]發現不同種族人群中陰道菌群組成存在差異，反映了遺傳因素的作用，但不排除非遺傳風險因素，如社會文化和衛生習慣。此外，有文獻[14-15]報道，陰道乳酸桿菌含量與機體內雌激素濃度呈正相關，但血雌激素濃度與陰道CSTs的確切關系尚不明確。

圖2 HPV16陽性、HPV18陽性和HPV陰性人群的陰道微生物菌群構成PCA分析Fig.2 PCA analysis of vaginal microflora in HPV16 positive, HPV18 positive and HPV negative populationsHPV:human papilloma virus；PCA:principal components analysis.PC1:principal components of Principal Component Analysis； PC2:the second principal components of Principal Component Analysis.

圖3 LEfSe 分析顯示HPV16感染時標志性陰道微生物菌群或菌種Fig.3 LEfSe analysis showed markers of vaginal microbial flora or strain in HPV 16 positive populationHPV:human papilloma virus.

圖4 LEfSe 分析顯示HPV18感染時標志性陰道微生物菌群或菌種Fig.4 LEfSe analysis showed markers of vaginal microbial flora or strain in HPV 18 positive populationHPV:human papilloma virus.

3.2 高危型HPV與VMB的關系

Lee等[16]對同卵雙胎中陰道微生物菌群的研究表明梭菌屬尤其纖毛菌屬(Sneathiaspp.)可作為HPV感染的微生物標志，HPV陽性女性的陰道微生物多樣性較HPV陰性女性增多且伴乳酸桿菌含量顯著減少。Gao等[17]研究發現，與HPV陰性女性相比，HPV陽性女性陰道微生物具有更大的生物多樣性且加氏乳酸桿菌(L.gasseri)和加德納菌屬(G.vaginalis)比例明顯升高。Brotman等[18]研究發現，與以卷曲乳桿菌(L.crispatus)為主的CST I相比，乳酸桿菌屬缺乏的CST-IV A型陰道微生物狀態更容易出現HPV感染。CST IV型厭氧菌屬增多還包括普氏菌屬、腸球菌屬等，Dareng等[19]研究表明新發HR-HPV感染與乳酸桿菌大量減少而厭氧菌大量增多有關，尤其是普氏菌(Prevotella)和纖毛菌(Leptotrichia)大量增多可作為HR-HPV感染相關的標志。然而，本研究中陰道各CSTs 與HPV感染無明顯關性，可能與本研究中CST IV為人群最常見的陰道微生物菌群有關，需要進一步觀察以CST IV為主的人群隨后計算HPV的發生率。

1999年，Rajamanoharan等[13]關于坦桑尼亞婦女的研究發現，加德納菌屬(G.vaginalis)和惰性乳桿菌(L.iners)是人群中最普遍存在的陰道微生物群，與本研究中無論HPV陽性還是陰性人群，CST IV 和CST III為最常見的陰道微生物群相一致。CST IV型陰道微生物菌群以厭氧菌屬占主要地位，包括加德納菌、普氏菌屬、纖毛菌屬、腸球菌屬等[9-10]，由于樣本量限制，本研究中雖然高危型HPV陽性與陰道各CSTs無明顯相關性，但進一步PCA分析表明HPV16陽性人群陰道微生物菌群構成顯著不同于HPV陰性人群和HPV18陽性人群，筆者發現HPV16陽性人群陰道微生物菌群多樣性增加，在其構成上，無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)僅存在于HPV16陽性人群，而HPV18型陽性人群陰道微生物菌群以乳酸桿菌屬為主導地位，HPV陰性人群以厭氧菌屬為主導地位，尤以加德納菌屬為主，并且HPV陰性和HPV18陽性人群無明顯生物多樣性增加，物種分布相對均勻。說明高危型HPV與VMB構成有一定相關性，但由于CST IV分類的籠統性，樣本數量較少，需進一步進行CST IV亞型分類來研究高危型HPV與VMB的關系。

本研究LEfSe分析表明無乳鏈球菌可作為HPV16感染的微生物標志物，無乳鏈球菌屬于厚壁菌門-乳酸桿菌目-鏈球菌科-鏈球菌屬，同乳酸桿菌屬同屬于厚壁菌門-乳酸桿菌目，為需氧或兼性厭氧菌，并非嚴格厭氧菌，說明并非只有厭氧菌屬可引起陰道CST IV轉變，且陰道CST IV普遍存于HPV陰性和陽性人群中，因此HPV感染與陰道微生物菌群構成與轉變相關，但并不一定都是陰道菌群的CST IV轉變[20-21]。既往研究傾向于采用HC2測定脫落宮頸細胞HPV感染與否，無具體型別判定，Dareng等[19]和Gillet等[22],研究中雖測定13種高危型別以及24種低危型別，但并未分析各型別陽性與陰道微生物菌群的關系。因此由于目前尚無特定HPV型別感染與陰道微生物菌群關系的研究，本結論是否能推廣，需要擴大樣本研究。

本研究為橫斷面研究，局限于評估陰道微生物菌群與HPV16、18型感染的相關性，但不能推斷兩者間的因果關系。本研究另一個局限性在于，雖然評估了CSTs與HR-HPV16、18新發感染之間的相關性，但與持續的HR-HPV感染相比，新發感染的HR-HPV與宮頸癌和癌前病變的相關性較弱，且HPV的感染狀態也會波動[23-24]，可能在收集樣本時病毒已消退[25]。因此，筆者將繼續隨訪本次納入研究者，以確定這些相關性是否會隨著持續的HR-HPV感染而改變。