乙酰丙酸-十二烷基硫酸鈉對結核分枝桿菌的殺滅作用及其安全性毒理學評價

呂霞麗 李自慧 潘麗萍 賈紅彥 張宗德 劉 洋

(首都醫科大學附屬北京胸科醫院 北京市結核病胸部腫瘤研究所 耐藥結核病研究北京市重點實驗室，北京 101149)

結核分枝桿菌是引起結核病的病原菌，嚴重威脅著人類的健康，切斷結核分枝桿菌傳播途徑是控制結核病傳播的重要措施之一。目前常用的結核分枝桿菌消毒劑有含碘類、含氯類、含醛類、過氧化物類等。這些消毒劑對結核分枝桿菌都有一定的殺滅作用但也均存在不同的不良反應。如含碘類消毒劑會導致過敏[1]，甚至會引起甲狀腺疾病[2]等嚴重后果。含氯類消毒劑對人體皮膚黏膜造成損害，如高濃度的84消毒液(次氯酸鈉)可致使皮膚發白、水腫發炎、水皰，致使眼部疼痛、流淚、潰瘍等[3]；84消毒液對操作臺面和金屬器械存在腐蝕性[4]。含醛類消毒劑有強刺激性、毒性和腐蝕性，甚至能引起過敏和哮喘[5]。過氧化物類消毒劑易分解、刺激性強，可引起DNA損傷、基因突變、致癌等[6]。因此，迫切需要更為安全有效的消毒劑切斷結核分枝桿菌的擴散傳播。

乙酰丙酸-十二烷基硫酸鈉(levulinic acid，sodium dodecyl sulfate，LVA-SDS)是一種廣譜的，殺滅作用較強的新型消毒劑[7-8]。LVA主要生產原料是含纖維素的可再生原料(比如高粱[9]等)，因此不僅成本低、產量高，而且無害無污染。經過美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration，FDA)認證和批準[10]，LVA可以加入到化妝品、調味劑、煙草等食品或者日常用品中，具有很好的安全性。SDS也是FDA認證的多功能添加劑，是一種活性添加劑，已經廣泛用于日常生活中，比如添加到蛋清、果汁、植物油和明膠中等[11]，其安全性也得到了認可。可見LVA-SDS確實具有安全性好等優點，且對大腸桿菌、沙門菌、人類諾瓦克病毒等多種微生物均有較好的殺滅作用，但國內對結核分枝桿菌的殺滅作用的研究報道較少。因此，本研究將LVA和SDS簡單混合后，初步探討對結核分枝桿菌標準株H37Rv和耐多藥結核分枝桿菌臨床分離株的殺滅作用，并對其在實際應用時的安全性進行評價。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1)菌株：結核分枝桿菌標準株H37Rv(ATCC_27294)，耐多藥結核分枝桿菌臨床分離株(同時對利福平、異煙肼耐藥，臨床藥敏編號2202)，均來自首都醫科大學附屬北京胸科醫院國家結核病臨床實驗室菌株庫。

2)消毒劑：純度98%，密度1.134 g/mL的乙酰丙酸(Acros Organics公司, 美國)(按體積分數配制所需的不同濃度溶液)，十二烷基硫酸鈉(北京鼎國生物技術有限責任公司)(按質量分數配制所需的不同濃度溶液)，兩者具體配比參考文獻[9]；有效氯含量為1 000 mg/L的次氯酸鈉(北京洗得寶消毒制品有限公司)，商用名“84消毒液”(按質量分數配制)。

3)中和劑：LVA-SDS中和劑[7]為0.1 mol/L PBS溶液，次氯酸鈉中和劑[12-13]為5 g/L硫代硫酸鈉、3 g/L卵磷脂、10 g/L吐溫-80的PBS溶液。

4)有機干擾物：3%(體積分數)牛血清白蛋白(BSA)。

5)試驗動物：SPF級BALB/c小鼠，體質量18～20 g，采用區組隨機化分組，雌雄各半，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號：SYSK(京)2015-0007。該動物實驗經過醫院倫理委員會批準(批準文號：2017-6)。

1.2 懸液定量殺菌試驗[13]

1)菌懸液制備：在無菌磨菌瓶中加入1～2滴10%(體積分數)吐溫-80水溶液，用無菌吸管尖端或無菌接種環刮取2～3周改良羅氏培養基處于對數生長期的新鮮菌落，置于磨菌瓶中。之后旋緊瓶蓋在渦旋振蕩器上振蕩30～60 s。靜置10 min后，打開瓶蓋，加入約2 mL無菌0.9%(質量分數)氯化鈉注射液，輕輕晃動后靜置片刻，使菌液中的大塊物質沉淀。用無菌吸管吸取中上部的菌液約1 mL，轉移至另一無菌試管中，與麥氏比濁管比濁。逐漸滴加無菌0.9%(質量分數)氯化鈉注射液，直至菌液濁度與標準麥氏比濁管一致，即得到1 mg/mL的菌懸液，備用。

2)中和劑鑒定試驗：具體操作詳見2002年版《消毒技術規范》[13]規定的中和劑試驗方法，現簡述如下：設置平行6組實驗，按照懸液定量殺菌試驗程序進行。①消毒劑+菌懸液；②(消毒劑+菌懸液)+中和劑；③中和劑+菌懸液；④(消毒劑+中和劑)+菌懸液；⑤稀釋液+菌懸液(正常菌陽性對照)；⑥稀釋液+中和劑+培養基(陰性對照)。其中稀釋液為去離子水；②組和④組區別在于：④組消毒劑與中和劑先接觸，終止消毒劑的殺滅效能；而②組消毒劑與菌懸液先接觸，之后使用中和劑，主要用于控制消毒劑的殺滅時間。消毒劑與細菌懸液作用5 min，試驗在常溫下進行。試驗重復3次(每次3個重復，共做了3次)均符合2002年版《消毒技術規范》的中和劑評定標準時，表明所選中和劑及其濃度適宜。

3)懸液定量殺菌試驗：在無菌試管內加入0.5 mL菌懸液和0.5 mL有機干擾物[3%(體積分數)BAS]，置于(20±1)℃水浴中備用。加入4 mL倍比稀釋的LVA-SDS消毒劑[陽性對照為0.9%(質量分數)氯化鈉注射液，陰性對照為1 000 mg/L含氯消毒劑]，立即混勻。作用5、15、30 min后，取0.5 mL混合液加入4.5 mL中和劑，混合中和作用10 min。取0.1 mL混合液置于7H10固體培養基上，用L棒涂抹均勻，37 ℃恒溫箱中培養1個月，觀察結果并記錄菌落總數(CFU/mL)，計算平均殺滅對數值(N)。所有試驗均重復3次。按照下列公式計算平均殺滅對數值：平均殺滅對數值(N)=對照組平均活菌濃度的對數值(No)-試驗組活菌濃度的對數值(Nx)。

1.3 消毒劑的安全性毒理學評價試驗[13]

1)急性經口毒性試驗：本實驗選用該方法用于評價消毒劑的急性毒性反應。采用一次最大限度試驗法。選用SPF級BALB/c小鼠12只，每組6只，雌雄各半。試驗前小鼠隔夜禁食12 h，不禁水。參照2002年版《消毒技術規范》，采用灌胃方式，按照0.4 mL·20 g-1給予受試液[20%(體積分數)LVA+2%(質量分數)SDS]，用灌胃針頭將受試液經口一次給予動物，連續觀察14 d，觀察并記錄動物中毒的表現和死亡情況，計算LD50(采用累積法計算LD50)。試驗結束后，處死存活動物，進行解剖，肉眼觀察是否出現組織和臟器異常。

2)蓄積毒性試驗：本實驗選用該方法用于評價消毒劑的慢性毒性反應。選用SPF級BALB/c小鼠12只，每組6只，雌雄各半。試驗前小鼠隔夜禁食12 h，不禁水。采用灌胃方式，每天灌胃一次，按照0.4 mL·20 g-1計算染毒量，每4天為一期。第一期劑量為0.1 LD50，以后每期的劑量按照《消毒技術規范》中定期遞增染毒劑量用表中所示遞增，直至半數動物死亡為止，計算累積總劑量即為LD50(n)。如果給藥28天，死亡動物仍不足半數，即停止實驗。蓄積系數(K)公式：K=LD50(n)/LD50，計算并確定蓄積毒性分級。

3)皮膚刺激試驗：本實驗選用該方法用于評價消毒劑對皮膚是否存在刺激性。選用SPF級BALB/c小鼠6只，雌雄各半。試驗前24 h觀察小鼠耳緣皮膚是否完好，無破損，次日將消毒液(20%LVA+2%SDS)直接涂抹于一側完整的皮膚上，另一側作為空白對照。分別于1、24、48 h后觀察皮膚的局部反應，根據有無紅斑和水腫形成，進行皮膚反應刺激評分。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 中和劑鑒定試驗

第1組無菌落生長。第2組有菌落生長，較第1組為多，但較第3、4、5組為少。第3、4、5組，組間菌落數在1×107～5×107CFU/mL，誤差率不超過15%。第6組無菌落生長，詳見表1。結果表明，0.1 mol/L PBS溶液可以有效中和濃度20%(體積分數)LVA、20%(體積分數)LVA+2%(質量分數)SDS的消毒劑對結核分枝桿菌標準菌株H37Rv和耐多藥結核分枝桿菌臨床分離株的殘留作用，且中和劑及其產物對試驗菌生長和培養基無不良影響，符合有效中和劑結果判定要求。5 g/L硫代硫酸鈉、3 g/L卵磷脂、10 g/L吐溫-80的PBS溶液均可以有效中和濃度為1 000 mg/L的次氯酸鈉，符合有效中和劑結果判定要求。

2.2 懸液定量殺菌試驗結果

統計學分析結果顯示，20%(體積分數)LVA和20%(體積分數)LVA+2% (質量分數)SDS作用30min對菌懸液內結核分枝桿菌標準株H37Rv的殺滅對數值(5.03 ±0.17vs5.53 ±0.38)比較，差異有統計學意義(P<0.001)；20%LVA 及20%LVA+2%SDS和1 000mg/L次氯酸鈉(6.20 ±0.00)的殺滅對數值比較，差異均有統計學意義(P<0.001)，詳見表2。

表1 含氯消毒劑、LVA和LVA-SDS消毒劑的中和劑鑒定試驗結果Tab.1 Neutralizer qualification test results for chlorine-containing disinfectants, LVA, and LVA-SDS disinfectants

LVA：levulinic acid；SDS：sodium dodecyl sulfate.

20%(體積分數)LVA和20%(體積分數)LVA+2% (質量指數)SDS作用30min對菌懸液內耐多藥結核分枝桿菌臨床分離株的殺滅對數值(5.03 ±0.15vs5.12± 0.06)比較，差異有統計學意義(P<0.05)；20%(體積分數)LVA 及20%(體積分數)LVA+2%(質量分數)SDS和1 000mg/L次氯酸鈉殺滅對數值(6.17 ±0.00)比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；詳見表3。含有效氯1 000mg/L的“84消毒液”對結核分枝桿菌的殺滅作用強于20%(體積分數)LVA和20%(體積分數)LVA+2% (質量分數)SDS。

表2 LVA-SDS在不同濃度、時間條件下對結核分枝桿菌標準株H37Rv的殺滅作用Tab.2 Killing effect of LVA-SDS on Mycobacterium tuberculosis standard strain H37Rv at different concentrations and times

表3 LVA-SDS在不同濃度、時間條件下對耐多藥結核分枝桿菌臨床分離株的殺滅作用Tab.3 Killing effect of LVA-SDS on clinical isolates of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis at different concentrations and times

2.3 LVA-SDS的安全性毒理學試驗結果

1)急性經口毒性試驗：結果為LD50>5 000 mg/kg，參照《消毒技術規范》[13]中的毒性評價可知，該消毒劑屬實際無毒級。試驗期間實驗動物未出現異常，無死亡。實驗結束后，解剖處死的實驗動物，肉眼觀察未見任何組織或臟器異常。

2)蓄積毒性試驗：試驗連續進行28 d，小鼠均無死亡，蓄積系數K>5，參照《消毒技術規范》[13]中的蓄積毒性分級可知，該消毒劑為輕度蓄積毒性。

3)皮膚刺激試驗：觀察1、24、48 h后，結果顯示實驗動物皮膚刺激反應無紅斑和水腫形成，皮膚刺激積分均為0，皮膚刺激指數<0.5，參照《消毒技術規范》[13]中的皮膚刺激評價標準可知，對小鼠皮膚無刺激性。

3 討論

結核病是目前由單一致病菌導致死亡最多的疾病，是全球關注的重大公共衛生問題之一。我國是全球27個耐多藥肺結核高負擔國家之一，2007-2008年全國結核病耐藥性基線調查結果顯示，肺結核患者中耐多藥率為8.32%。據此估算，我國每年新發耐多藥結核患者12萬例，耐多藥結核病患者數位居全球第2位。耐多藥肺結核患者與普通肺結核患者相比，傳染期更長，傳染危害更大[14]。消毒劑是切斷結核分枝桿菌傳播途徑的有效手段之一，對消毒劑的研究應引起研究者的重視。

本研究結果表明，LVA-SDS消毒劑對結核分枝桿菌標準株H37Rv、耐多藥結核分枝桿菌臨床分離株均存在較好的殺滅作用。本實驗所設定的一系列梯度濃度的消毒劑得到的殺滅試驗結果顯示，LVA-SDS消毒劑的殺滅作用隨著作用時間和作用濃度的增加不斷增強；20%LVA、20%LVA+2%SDS對結核分枝桿菌標準株H37Rv、耐多藥結核分枝桿菌臨床分離株作用30 min后的平均殺滅對數值均>5.00，且連續培養觀察2～3個月后未見新鮮菌落生長。20%(體積分數)LVA、20%(體積分數)LVA+2%(質量分數)SDS、1 000 mg/L次氯酸鈉和陽性對照組對結核分枝桿菌及耐多藥結核分枝桿菌臨床分離株作用30 min的殺滅作用差異均有統計學意義；相比同濃度的LVA， LVA-SDS聯合作用的殺滅作用會更趨于穩定，效果會更好，此結果與文獻報道[9,15]一致，即兩者具有協同殺滅作用。LVA-SDS對結核分枝桿菌標準株H37Rv、耐多藥結核分枝桿菌臨床分離株殺滅作用與消毒劑的濃度和作用時間成正相關。根據本研究結果LVA-SDS有可能用于臨床結核分枝桿菌的滅菌消毒，如器械消毒、空氣消毒等。結合本研究獲得的毒理學結果，LVA-SDS在未來殺滅結核分枝桿菌的過程中具有對皮膚無刺激性、對人體無急性和慢性毒性等優勢。可見，LVA-SDS對結核分枝桿菌除了有很好的殺滅作用，還具有很好的安全性、無腐蝕性、無害無污染、無刺激性、無不良作用等優點[9,15-16]。LVA-SDS混合液在常溫下保存60 d性質穩定且殺滅活性不變[17]。

1 000 mg/L含氯消毒劑的對照組對結核分枝桿菌標準株H37Rv、耐多藥結核分枝桿菌臨床分離株作用30 min后的平均殺滅對數值均>5.00，可達到完全殺滅作用?？梢?，含氯消毒劑確實存在較強的殺滅作用。與含氯消毒劑相比較，LVA-SDS消毒劑雖然在短時間和低濃度時的殺滅作用稍差，但是高濃度和長時間作用后卻有著不錯的殺滅效果。另外LVA-SDS具有無害無污染、安全性好等優點，而含氯消毒劑具有刺激性強和腐蝕性等缺點。因此，LVA-SDS用于結核分枝桿菌的消毒工作具有不錯的應用前景。

本研究顯示，LVA-SDS對結核分枝桿菌標準株H37Rv、耐多藥結核分枝桿菌臨床分離株具有較好的殺滅作用，且毒理學實驗結果顯示LVA-SDS消毒劑屬實際無毒級，輕度蓄積毒性作用且對皮膚無刺激性，具有較強的實際應用價值。筆者在后續研究中會結合醫院感染控制的實際需要，不斷改變LVA-SDS對結核分枝桿菌殺滅作用的實驗條件和影響因素，進一步提高LVA-SDS消毒劑的應用價值。